劉麗娜， 楊鋒

(南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院整形外科，湖南省衡陽市 421001)

瘢痕疙瘩(keloid，KD)是創(chuàng)傷后皮膚及皮下組織異常修復，導致成纖維細胞異常增殖，膠原纖維、細胞外基質過度沉積而形成的一種病理性瘢痕，具有侵襲性和復發(fā)性[1-2]。目前，手術切除、化學藥物注射治療、物理治療以及脂肪干細胞移植等治療手段雖能在一定程度上抑制KD增生，但存在治療周期較長、治療部位局限、不良作用及復發(fā)率大等缺陷[3]。生物信息學分析和網(wǎng)絡藥理學分析是通過數(shù)據(jù)挖掘、數(shù)據(jù)整合等方式，將疾病與藥物進行相互映射，從而獲取核心基因、潛在靶點，為藥物靶點治療帶來了新思路。本研究擬運用生物信息學和網(wǎng)絡藥理學分析的方法對KD和丹皮酚進行整合分析，篩選在KD發(fā)病過程中的核心基因、丹皮酚治療KD的潛在靶標蛋白，建立PPI網(wǎng)絡并進行網(wǎng)絡拓撲分析、基因功能注釋，為丹皮酚治療KD提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)資料

KD致病相關基因來自于CTD數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫，丹皮酚直接靶點基因來自于TCMSP數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫。GEO數(shù)據(jù)驗證使用的芯片數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫中KD數(shù)據(jù)集，編號為GSE6820，包含36個樣本。該數(shù)據(jù)集基于GPL1521平臺。

1.2 篩選侯選靶點和候選基因

在CTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索并下載KD致病基因。在TCMSP和PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索并下載丹皮酚直接靶點基因，將基因名稱轉化為gene symbol形式，合并兩數(shù)據(jù)庫中結果。將KD致病基因及丹皮酚直接靶點分別輸入到蛋白質相互作用數(shù)據(jù)庫(STRING：function protein association networks，STRING，https://cn.string-db.org)中，獲得蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)文件，導入Cytoscape3.7.1軟件中構建PPI網(wǎng)絡，運用CytoHubba插件進行分析，篩選出KD候選基因和丹皮酚候選靶點。

1.3 藥物-疾病PPI網(wǎng)絡構建與分析

將KD候選基因和丹皮酚候選靶點均導入STRING中，并使用Cytoscape軟件構建疾病-藥物PPI網(wǎng)絡圖。對候選靶點及候選基因取交集，獲取潛在藥物靶點，采用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape3.7.1軟件構建PPI網(wǎng)絡。采用CytoHubba插件分析degree值。

1.4 潛在靶點基因的功能注釋及數(shù)據(jù)可視化

通過DIVAD軟件(database for annotation，visualization and integrated discovery，https://david.ncifcrf.gov/conversion.jsp)進行基因功能富集(GO)分析和信號通路富集(KEGG)分析。運用Sangerbox生物信息平臺進行可視化。采用Cytoscape軟件分析GO基因功能、KEGG信號通路與潛在藥物靶點間的相互作用。

1.5 GEO芯片數(shù)據(jù)集潛在靶點驗證

下載GSE6820原始數(shù)據(jù)文件，使用R軟件對文件進行合并及標準化。利用平臺注釋文件對探針進行注釋，剔除沒有匹配到基因的探針；對于不同探針映射到同一基因，則選取不同探針均值為最終表達值。利用limma包計算基因表達差異的P值和表達Fold Change值，選取P<0.05且|log2FC|>1作為篩選指標，篩選出KD組織中差異性表達基因。

2 結 果

2.1 KD候選基因和丹皮酚候選靶點

CTD數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫中分別獲得KD致病基因6 271和534個，取交集獲取KD致病相關基因312個。以degree>8(mean degree)為篩選條件，獲取KD候選基因143個。

TCMSP數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫中分別獲得丹皮酚相關基因27和35個，合并后得到丹皮酚直接靶點基因57個。以degree>5(mean degree)為篩選條件，獲取KD候選基因29個。

2.2 PPI網(wǎng)絡分析

構建的KD候選基因與丹皮酚候選靶點PPI網(wǎng)絡(圖1)包含個181個節(jié)點和2 376條邊。

圖1 KD候選基因與丹皮酚候選靶點PPI網(wǎng)絡圖圖標的顏色越深代表對應基因的degree值越大。

篩選出潛在藥物靶點共11個，分別是核轉錄因子κB抑制劑(nuclear transcription factor κB inhibitors,NFKBIA)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、磷脂酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)、蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶1(protein serine threonine kinase 1,Akt1)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、核轉錄因子-κB1(nuclear transcription factor-κB1,NF-κB1)、纖維連接蛋白1(fibronectin，F(xiàn)N1)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)，CytoHubba插件分析潛在藥物靶點的degree值依次為7、8、3、8、7、10、10、9、7、7、10，并構建潛在藥物靶點PPI網(wǎng)絡(圖2)。

2.3 潛在藥物靶點的基因注釋及數(shù)據(jù)可視化分析

以P<0.05為條件，篩選出GO基因功能富集條目共37個、KEGG條目21個。生物過程(BP)條目21個，分子功能(MF)條目9個，細胞定位(CC)條目7個。BP主要富集于負向調節(jié)細胞凋亡、正向調節(jié)細胞增殖等；MF主要富集于蛋白結合、轉錄因子結合及酶結合等；CC主要富集于細胞質、細胞核及線粒體等(圖3)。KEGG信號通路主要富集于磷脂腺肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)、凋亡等信號通路中(圖3)。潛在藥物靶點與GO功能和KEGG信號通路之間的相互關系見圖4。

圖2 潛在藥物靶點PPI網(wǎng)絡圖圖標的顏色越深代表對應潛在藥物靶點的degree值越大。

圖3 潛在藥物靶點基因富集分析圖A為分子功能(MF)氣泡圖；B為細胞定位(CC)氣泡圖；C為生物過程(BP)的氣泡圖；D為信號通路氣泡圖。

2.4 作用靶點驗證結果

GSE6820數(shù)據(jù)集進行差異性表達分析后，發(fā)現(xiàn)該數(shù)據(jù)集僅對NFKBIA、Bcl-2、TGF-β1、MAPK1、IL-6、NF-κB1、FN1和Caspase-3這8個靶點進行了檢測，以P<0.05且|log2FC|>1為條件，篩選GSE6820中的差異性表達基因，發(fā)現(xiàn)NFKBIA、NF-κB1、 TGF-β1符合篩選條件(表1)。

圖4 潛在藥物靶點與GO功能和KEGG信號通路網(wǎng)絡圖PA1～PA21表示信號通路；MF1～MF9表示分子功能；BP1～BP21表示生物過程；CC1～CC7表示細胞定位。

表1 作用靶點驗證結果

3 討 論

KD在整形外科中是一類難治性的疾病，由于其反復發(fā)作導致無法治愈。目前KD的治療方式較多，但治療效果不確切、預后不佳。丹皮酚是一種來自于牡丹干燥根莖中的中藥單體成分，來源廣泛且提取技術成熟，在腫瘤治療領域應用相當廣泛。丹皮酚可以通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、改變腫瘤細胞生存周期、影響腫瘤細胞周圍毛細血管的增殖、抑制上皮間質轉化等方式起到抗腫瘤的作用[4]。也有研究表明，丹皮酚可以抑制增生性瘢痕的增長[5]。鑒于KD與腫瘤及增生性瘢痕存在相似性，推測丹皮酚可以抑制KD成纖維細胞的過度增殖并促進異常增殖成纖維細胞凋亡。

本文選擇CTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取KD致病基因。CTD數(shù)據(jù)庫可將化學、基因、表型、疾病和暴露因素的毒理學信息聯(lián)合起來，包含了KD在內(nèi)的7 200種疾病的基因表達數(shù)據(jù)。GeneCards是人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫，也包含有KD致病相關基因的數(shù)據(jù)信息。選用TCMSP和PubChem數(shù)據(jù)庫獲取丹皮酚直接靶標基因。TCMSP數(shù)據(jù)庫包含化學物質、靶點和藥物靶點網(wǎng)絡，可以獲得中藥成分對應的各種化學信息等。PubChem是一種化學模組數(shù)據(jù)庫，包含3個子數(shù)據(jù)庫，PubChem BioAssay庫用于儲存生化實驗數(shù)據(jù)，PubChem Compound庫用于存儲整理后的化合物化學結構信息，PubChem SubStance用于儲存機構和個人上傳的化合物原始數(shù)據(jù)，本研究所需的丹皮酚直接靶點基因來自于PubChem Compound數(shù)據(jù)庫中。靶點驗證時所需的數(shù)據(jù)來自于GEO數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫中包含有腫瘤和非腫瘤數(shù)據(jù)資料，可對疾病的差異性表達基因進行篩選和分析。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學和生物信息學的方法篩選出11個潛在藥物靶點，主要富集于PI3K/Akt信號通路和凋亡信號通路。在PI3K/Akt信號通路中，PI3K接受細胞膜外的信號刺激后，可將PIP2磷酸化為PIP3，進一步激活Akt，最終影響下游NF-κB、mTOR及FoXO信號通路[6-8]。PTEN能逆轉PIP2-PIP3的磷酸化過程，降低PI3K/Akt信號通路的活性[9]。劉琴等[10]發(fā)現(xiàn)，婦科腫瘤疾病中均存在PTEN/PI3K/Akt信號調控的異常激活。陳晴晴等[11]發(fā)現(xiàn)PTEN表達下調與肝纖維化相關，通過激活PI3K/Akt信號通路，促進肝纖維化。許帥等[12]發(fā)現(xiàn)部分中藥可誘導PTEN高表達而治療糖尿病腎病。綜合分析潛在藥物靶點與凋亡通路直接的相互關系，丹皮酚調節(jié)的是凋亡相關半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)依賴性線粒體凋亡相關通路。丹皮酚主要作用靶點為Bcl-2和Caspase-3。Bcl-2分泌的抑凋亡蛋白Bcl-2主要發(fā)揮穩(wěn)定線粒體膜結構、功能完整性的作用[13]。當線粒體膜上Bcl-2的表達下調時，線粒體膜通透性和穩(wěn)定性改變，促進Cyt-c的釋放和鈣離子的跨膜流動[14]，誘導凋亡復合體的形成，最終導致Caspase-3參與的細胞凋亡相關程序激活[15]。Caspase-3基因編碼的蛋白為Caspase-3，為細胞凋亡過程的主要執(zhí)行蛋白，通過降解PARP、DFF-45，導致DNA修復抑制并誘導其碎片化，促進細胞凋亡。在腫瘤細胞中，凋亡信號通路常常處于抑制狀態(tài)，Zhao等[13]發(fā)現(xiàn)大鼠結腸癌細胞中IL-6及Bcl-2高表達，抑制癌細胞凋亡。

GEO數(shù)據(jù)庫的驗證發(fā)現(xiàn)，潛在藥物靶點中NFKBIA、NF-κB、TGF-β1在KD成纖維細胞及正常成纖維細胞的表達具有統(tǒng)計學意義，主要富集于NF-κB信號通路中。NF-κB信號通路的激活受多條信號通路的影響，當PI3K/Akt信號通路激活時，NF-κB信號通路可被激活，促進細胞增殖、分化及各種蛋白合成；NF-κB還可以受到多種細胞因子的調控，TNF-α受體相關因子、血管內(nèi)皮生長因子可激活NF-κB信號通路，促進炎癥反應、抑制細胞凋亡、促進毛細血管新生等[16]。

綜上所述，丹皮酚主要作用于NFKBIA、mTOR、Bcl-2、PTEN、TGF-β1、Akt1、MAPK1、IL-6、NF-κB1、FN1、Caspase-3，影響PI3K/Akt信號通路、Apopotsis信號通路和NF-κB信號通路來抑制KD的發(fā)生發(fā)展。