田甜， 韋海林， 陸敦， 陸巖

(河池市婦幼保健院兒科，廣西省河池市547000)

隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(neonatal intensive care unit,NICU)技術(shù)的不斷完善，新生兒呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome,RDS)的搶救效果得到明顯提高，機(jī)械通氣等呼吸支持治療能有效改善其臨床癥狀，但也帶來了呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)問題，VAP不僅會增加治療時間與費(fèi)用，還可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)后遺癥[1-3]。了解RDS合并VAP患兒肺部菌群特征，以指導(dǎo)臨床抗生素選擇，對盡早控制感染、改善患兒預(yù)后具有重要意義。隨著抗生素的廣泛使用致病菌菌種不斷變遷，為了解近年VAP患兒肺部主要致病菌及菌群多樣性特點(diǎn)，本研究對RDS合并VAP新生兒肺部致病菌分布以及菌群多樣性特征進(jìn)行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選擇本院2017年1月—2021年1月行氣管插管RDS新生兒70例，根據(jù)是否并發(fā)VAP分為VAP組(30例)和對照組(40例)。VAP診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[4]。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合新生兒RDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，患兒具有發(fā)生RDS的高危因素，臨床有呼吸窘迫相關(guān)表現(xiàn)，體格檢查可見胸廓扁平，聽診呼吸音低，偶可聞及細(xì)濕啰音，聯(lián)合胸部X線片、血?dú)夥治?、泡沫試?yàn)即可確診；均參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行RDS評分。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除新生兒濕肺、胎糞吸入、產(chǎn)時窒息致RDS，合并呼吸系統(tǒng)先天發(fā)育畸形；合并先天性心臟病。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，家長知情同意。新生兒RDS評分VAP組高于對照組(P<0.05)，兩組其他臨床資料比較差異無顯著性(P>0.05；表1)。

表1 兩組臨床資料的比較

1.2 細(xì)菌分離與鑒定

于患兒機(jī)械通氣48 h后，應(yīng)用抗生素治療前，采集痰液標(biāo)本，制備痰液震蕩液，接種于哥倫比亞血平板與流感嗜血桿菌分離平板，MicroScan WalkAway-40全自動細(xì)菌鑒定/藥敏測試儀鑒定細(xì)菌種屬。

1.3 菌群豐度和香農(nóng)-維納指數(shù)的測定

分別于氣管插管第1、2、3、4、5天采集患兒痰液標(biāo)本。應(yīng)用細(xì)菌微量DNA提取試劑盒提取DNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)基因片段設(shè)計(jì)通用引物，引物設(shè)計(jì)由上海生工公司合成。上游引物5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG GGCAGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。反應(yīng)體系包括DNA原液6 μL，預(yù)混液25 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 18 μL。循環(huán)程序94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)10次；94 ℃變性30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)25次；72 ℃延伸7 min。參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行DGGE檢測，PCR產(chǎn)物序列為195 bp，采用Decode系統(tǒng)進(jìn)行DGGE分析。采用Quantity One(BIO-RAD,America)軟件對DGGE條帶數(shù)目(豐度)與相似度進(jìn)行檢測，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入BIO-DAP軟件計(jì)算香農(nóng)-維納指數(shù)[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組患兒機(jī)械通氣和預(yù)后情況的比較

VAP組機(jī)械通氣時間、拔管后吸氧時間、重復(fù)插管上機(jī)率、死亡率均高于對照組(P<0.05；表2)。

表2 兩組患兒機(jī)械通氣和預(yù)后情況的比較

2.2 病原菌分布情況

VAP組30例患兒共檢出36株菌株，以革蘭氏陰性菌為主；檢出率前3位的病原菌分別為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和肺炎鏈球菌(表3)。

表3 VAP病原菌分布的情況(n=36) 單位：株(%)

2.3 兩組菌群豐度的比較

兩組患兒菌群豐度均從治療第2天即上升，且在第3～5天時維持較高水平，且VAP組第2～4天菌群豐度低于對照組(P<0.05；表4)。

2.4 兩組香農(nóng)-維納指數(shù)的比較

對照組肺部菌群香農(nóng)-維納指數(shù)從第2天即上升，且在第3～5天維持較高水平，VAP組從第3天開始上升，在第4～5天維持較高水平；且VAP組第2～4天香農(nóng)-維納指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05；表5)。

表4 兩組患兒菌群豐度的比較

表5 兩組患兒痰液菌群香農(nóng)-維納指數(shù)的比較

3 討 論

機(jī)械通氣等呼吸支持治療可有效改善RDS患兒臨床癥狀，改善患兒預(yù)后，但長期使用呼吸機(jī)將引起VAP，VAP已成為撤機(jī)困難、延長患兒住院時間的主要原因。VAP的發(fā)生將增加RDS的治療難度，并增加不良預(yù)后發(fā)生風(fēng)險。本研究中70例RDS患者共30例發(fā)生VAP，VAP發(fā)生率為42.86%。VAP組患兒死亡率遠(yuǎn)高于對照組，提示VAP的發(fā)生將增加不良預(yù)后發(fā)生風(fēng)險，這與謝朝云等[9]研究結(jié)論一致。VAP組患兒治療前RDS評分更高、機(jī)械通氣時間和拔管后吸氧時間更長，重復(fù)插管次數(shù)也更多，提示以上因素可能是增加VAP風(fēng)險的危險因素。

明確VAP常見致病菌，在早期經(jīng)驗(yàn)性用藥和改善患兒預(yù)后中具有重要意義。本研究采集VAP組患兒痰液行細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，VAP組30例患兒中共檢出36株菌株，以革蘭氏陰性菌為主，檢出率排前3位的病原菌分別為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和肺炎鏈球菌，鑒于藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議臨床經(jīng)驗(yàn)性選擇亞胺培南、環(huán)丙沙星等藥物進(jìn)行治療。

既往研究認(rèn)為，VAP的發(fā)病機(jī)制主要包括氣管插管表面細(xì)菌吸入或外界環(huán)境中病原菌入侵兩方面，且很長一段時間內(nèi)，肺部被認(rèn)為是無菌的。隨著研究技術(shù)的不斷進(jìn)展，高通量測序技術(shù)不斷促進(jìn)微生物組學(xué)的發(fā)展，該認(rèn)知逐漸被顛覆。16S rRNA是現(xiàn)臨床應(yīng)用范圍最廣的基因測序技術(shù)，可鑒別出不能培養(yǎng)的細(xì)菌[10]，Guss等[11]利用16S rRNA技術(shù)，在囊性纖維化患者痰液中發(fā)現(xiàn)了60多種細(xì)菌，提示肺部菌群是一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，且有研究提出，機(jī)械通氣患者肺部微生態(tài)失衡，正常負(fù)反饋機(jī)制被破壞，是導(dǎo)致感染的重要原因[12]。彭純穎等[13]研究報道，VAP患兒肺部菌群物種多樣性及豐度均發(fā)生明顯改變?；谝陨涎芯?，說明RDS合并VAP患兒也可能存在肺部微生態(tài)失衡。

本研究借助16S rRNA技術(shù)，對VAP患兒肺部菌群多樣性進(jìn)行研究，并憑借DGGE技術(shù)對細(xì)菌豐度以及香農(nóng)-維納指數(shù)進(jìn)行定量。結(jié)果提示，氣管插管初期，VAP組患兒及對照組患兒肺部菌群多樣性均較低，而隨著插管時間的不斷延長，兩組肺部菌群多樣性不斷增高，說明隨著插管時間的延長，患兒肺部細(xì)菌種類逐漸增多。但在插管治療第2～4天時，感染VAP的患兒肺部菌群豐度明顯低于對照組患兒，說明并發(fā)VAP患兒肺部細(xì)菌多樣性具有降低趨勢，肺部細(xì)菌多樣性下降可能是導(dǎo)致VAP的重要原因。在插管第5天，兩組肺部菌群豐度以及香農(nóng)-維納指數(shù)間差異無顯著性，可能與隨著插管治療時間的延長，部分VAP患兒病情不斷好轉(zhuǎn)，或VAP患兒對抗生素的耐藥增加，對照組患兒受到抗生素抑制等因素相關(guān)[14-15]。

綜上所述，RDS患兒機(jī)械通氣過程中VAP發(fā)生率高，引起VAP的主要致病菌包括肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌以及肺炎鏈球菌，機(jī)械通氣過程中肺部菌群多樣性降低對提示VAP具有重要警示作用。