顏宇龍， 萬丹婷， 周潔， 朱子豪， 鄧蒸蒸， 黃波

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省衡陽市 421001)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范圍內(nèi)第五大常見腫瘤，在中國，肝細(xì)胞癌的發(fā)病率排在腫瘤發(fā)病率中第4位，病死率排第2位，且近80%患者癥狀晚期才發(fā)現(xiàn)[1]。目前肝細(xì)胞癌的治療方法有肝移植、靶向藥物治療、手術(shù)切除、放療和局部消融等。在患者腫瘤細(xì)胞進(jìn)行放療同時也能對周圍正常細(xì)胞或組織產(chǎn)生的損傷為輻射旁效應(yīng)[2](the radiation-induced bystander effect,RIBE)。RIBE主要通過細(xì)胞縫隙鏈接(Gap junction intercellular communication,GJIC)、活化細(xì)胞因子參與自噬、外泌體等三大途徑發(fā)揮損傷作用，能導(dǎo)致基因不穩(wěn)定、炎癥反應(yīng)、DNA損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長異常等生物學(xué)效應(yīng)[3]。共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)基因能識別DNA損傷位點(diǎn)，輻射損傷可活化ATM來識別和修復(fù)DNA損傷[4]。KU60019是一種ATM激酶特異性的抑制劑，是高度有效的放射增敏劑。本研究探討ATM在輻射旁效應(yīng)中的調(diào)控作用及機(jī)制，為肝細(xì)胞癌放療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(HepG2)由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院周平坤研究員惠贈。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司(USA)；MTT、羅丹明B、Giemsa染液購自北京索萊寶科技有限公司；137Cs γ射線生物細(xì)胞輻照儀(型號為HXFS-IA)購自中國核動力原設(shè)備制造廠?；钚匝?reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自南京Vazyme生物科技有限公司。

1.2 輻射旁效應(yīng)細(xì)胞模型的構(gòu)建

137Cs γ射線生物細(xì)胞輻照儀照射HepG2細(xì)胞，劑量率為133.3 cGy/min，輻照總劑量為8 Gy。通過刺激液模式構(gòu)建輻射旁效應(yīng)模型，8 Gy輻照1 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，收集上清，用0.22 μm過濾頭過濾后構(gòu)成條件培養(yǎng)基，將條件培養(yǎng)基加入到未受輻照細(xì)胞中，共同培養(yǎng)1 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)分為空白組(NC組)、輻射旁效應(yīng)組(ICM組)、輻射旁效應(yīng)+KU60019組(聯(lián)合組)及單純輻照組(IR組)。NC組不做任何處理，新鮮普通培養(yǎng)基培養(yǎng)；ICM組于1.2構(gòu)成的旁效應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；聯(lián)合組培養(yǎng)液為旁效應(yīng)培養(yǎng)基中加入KU60019,使含KU60019旁效應(yīng)培養(yǎng)基的終濃度為7 μmol/L；IR組于新鮮普通培養(yǎng)基培養(yǎng)時單純8 Gy輻照處理。

1.4 MTT檢測細(xì)胞存活率

將HepG2細(xì)胞以3.0×104個/mL接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁，各組實(shí)驗(yàn)處理后培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL MTT以及90 μL培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清，每孔加入110 μL Formazan溶液，室溫下振蕩儀振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm波長處的光密度(OD)，分析各組細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞生長曲線實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

將HepG2細(xì)胞以5.0×103個/mL接種于24孔板中，各組完成實(shí)驗(yàn)處理后，每3天更換相應(yīng)的培養(yǎng)液，每隔24 h計數(shù)一次，連續(xù)計數(shù)7天。

1.6 細(xì)胞內(nèi)SOD活力、MDA含量、ROS水平的測定

將HepG2細(xì)胞以2.0×105個/mL水平接種于6 cm皿中，完成各組處理因素48 h后收集細(xì)胞。提取蛋白，酶標(biāo)儀490 nm處用BCA法測定各處理組樣品蛋白的水平。按照試劑盒說明書檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活力、MDA含量、ROS水平。

1.7 熒光分光光度法檢測線粒體膜電位

按1.6方法收集細(xì)胞，1 mL預(yù)先4 ℃處理的杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)重懸細(xì)胞，每管加入1 μL羅丹明B，使溶液質(zhì)量濃度為100 mg/L，避光孵育0.5 h，離心收集細(xì)胞，1 mL DPBS重懸細(xì)胞，熒光分光光度計檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)。最佳激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡

按1.6方法收集細(xì)胞，離心去上清，加入100 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide混勻液孵育5 min，最后加400 μL Binding Buffer混勻，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 KU60019濃度的確定

以DMSO作為KU60019溶劑，MTT檢測DMSO，1、3、5、7、9 μmol/L KU60019作用于細(xì)胞后觀察細(xì)胞的存活情況。結(jié)果表明，DMSO對細(xì)胞存活無明顯影響，24、48、72 h后，7、9 μmol/L KU60019能明顯抑制細(xì)胞增殖(P<0.05；圖1)，7 μmol/L KU60019對HepG2細(xì)胞毒性較9 μmol/L更小，故后續(xù)選用7 μmol/L KU60019進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 MTT檢測不同濃度KU60019對細(xì)胞存活率的影響a為P<0.05,與0 μmol/L組比較。

2.2 KU60019抑制ATM后降低細(xì)胞存活率

ICM組、聯(lián)合組、IR組細(xì)胞存活率低于NC組(P<0.05)，聯(lián)合組、IR組細(xì)胞存活率明顯低于ICM組(P<0.05；圖2)。

圖2 KU60019抑制ATM后降低細(xì)胞存活率a為P<0.05,與NC組比較;b為P<0.05,與ICM組比較。

2.3 KU60019抑制ATM后降低細(xì)胞增殖能力

IR組、聯(lián)合組細(xì)胞從第5天開始生長緩慢，細(xì)胞數(shù)明顯低于NC組和ICM組(P<0.05)；ICM組、聯(lián)合組、IR組細(xì)胞生長能力明顯低于NC組(P<0.05；圖3)。

圖3 KU60019抑制ATM后降低細(xì)胞增殖能力a為P<0.05,與NC組比較;b為P<0.05,與ICM組比較。

2.4 KU60019抑制ATM后對細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA、ROS的影響

與NC組比較，ICM組、聯(lián)合組、IR組細(xì)胞內(nèi)SOD活力下降，MDA含量和ROS水平升高(P<0.05)；與ICM組比較，聯(lián)合組、IR組細(xì)胞內(nèi)SOD活力下降，MDA含量和ROS水平升高(P<0.05；表1)。

表1 KU60019抑制ATM后對細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA、ROS的影響

2.5 KU60019抑制ATM后降低細(xì)胞線粒體膜電位

與NC組比較，ICM組、聯(lián)合組、IR組細(xì)胞線粒體膜電位降低(P<0.05)；與ICM組比較，聯(lián)合組、IR組細(xì)胞線粒體膜電位降低(P<0.05；圖4)。

圖4 KU60019抑制ATM后降低線粒體膜電位a為P<0.05,與NC組比較;b為P<0.05,與ICM組比較。

2.6 KU60019抑制ATM后促進(jìn)細(xì)胞凋亡

與NC組比較，ICM組、聯(lián)合組、IR組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)；與ICM組比較，聯(lián)合組、IR組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05；圖5)。

圖5 KU60019抑制ATM后促進(jìn)細(xì)胞凋亡a為P<0.05,與NC組比較;b為P<0.05,與ICM組比較。

3 討 論

目前，放射治療是肝細(xì)胞癌治療的主要方法之一，腫瘤細(xì)胞有不同程度的輻射抗性，腫瘤細(xì)胞生長速度快、增殖能力強(qiáng)，其增殖與凋亡失衡是腫瘤細(xì)胞抵抗輻射的重要原因[5-6]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)未施加任何處理因素時，空白組肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，生長速度快，且均高于其他處理組，IR和輻射刺激液作用后能對HepG2細(xì)胞存活產(chǎn)生明顯抑制。ATM是DNA損傷修復(fù)治療靶點(diǎn)，正常情況下ATM以無活性的二聚體形式存在，當(dāng)細(xì)胞受到輻射損傷時，ATM可活化介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與增殖等生物學(xué)通路，激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，進(jìn)行細(xì)胞自我損傷修復(fù)或?qū)е碌蛲霭l(fā)生[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)KU60019作用于HepG2細(xì)胞抑制ATM蛋白激酶表達(dá)后能明顯抑制HepG2細(xì)胞存活，且聯(lián)合組細(xì)胞存活率與增殖能力明顯低于ICM組。這說明KU60019抑制ATM能降低細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激的介入可介導(dǎo)輻射旁效應(yīng)，氧化還原穩(wěn)態(tài)是維持細(xì)胞正常增殖的重要因素之一，ATM活化后可以降低體內(nèi)活性氧水平，激活PI3K/Akt信號通路，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化損傷能力[9-10]。黃越等[11]發(fā)現(xiàn)組織受到損傷后，ATM被活化，能產(chǎn)生ROS、SOD等副產(chǎn)物，導(dǎo)致組織氧化還原系統(tǒng)失衡，發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。本文ICM組與IR組較NC組細(xì)胞ROS、MDA含量上升，SOD活力下降；當(dāng)抑制ATM蛋白激酶表達(dá)，聯(lián)合組較ICM組細(xì)胞ROS、MDA含量上升，SOD活力下降，這提示ATM參與此次輻射旁效應(yīng)氧化損傷過程。

線粒體能調(diào)節(jié)凋亡信號通路，線粒體內(nèi)膜含有很多帶有負(fù)電荷的糖蛋白，這些糖蛋白可引起線粒體膜電位發(fā)生變化[12]，從而細(xì)胞色素C可隨膜電位進(jìn)入細(xì)胞，參與細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)輻射旁效應(yīng)早期生物效應(yīng)[13]。本文ICM組與IR組較NC組細(xì)胞凋亡率增加，線粒體膜電位下降，聯(lián)合組較ICM組細(xì)胞凋亡率增加、線粒體膜電位下降。

綜上所述，ATM在輻射損傷調(diào)控作用中起到不可替代的作用，抑制ATM蛋白激酶表達(dá)，能使細(xì)胞對輻射旁效應(yīng)敏感性增加，氧化還原系統(tǒng)失衡，細(xì)胞抗氧化損傷能力降低，能阻礙細(xì)胞進(jìn)行自我損傷修復(fù)，使細(xì)胞增殖受到抑制，發(fā)生凋亡。這為提高肝細(xì)胞癌細(xì)胞的放射敏感性、進(jìn)一步闡明輻射旁效應(yīng)的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。