劉芳， 李志敏， 曹振華， 何慧， 蘇琦， 蘇波

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院 1.腫瘤研究所，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院應(yīng)用解剖與生殖醫(yī)學(xué)研究所，3.藥學(xué)院藥物藥理研究所，湖南省衡陽市 421001)

胃癌是中國第二大常見癌癥，是所有癌癥類型中的第三大死因[1]。大蒜素的抗癌作用高于其他化療藥物，毒性和不良反應(yīng)相對較小，二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是由大蒜素分解的活性產(chǎn)物之一[2]。DADS具有抗胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用[3]。

X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)通過作用凋亡蛋白Caspases抑制凋亡、促進腫瘤細胞增殖，并且參與信號通路調(diào)節(jié)、促進腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。DADS抑制胃癌細胞XIAP表達[5]，本文在此基礎(chǔ)上研究DADS是否通過下調(diào)XIAP抑制XIAP過表達胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

新生小牛血清(杭州四季青生物工程公司)；嘌呤霉素(Invitrogen公司)；DADS(Sigma公司)；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(Dojindo公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Promega公司)；抗XIAP、β-actin抗體(Abcam公司)；ECL發(fā)光試劑盒(Santa Cruz公司)；Matrigel基質(zhì)膠(BD公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和XIAP過表達細胞株構(gòu)建

人胃癌HGC27細胞(中山大學(xué)腫瘤防治中心饋贈)置于5%CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。GV358慢病毒空載體(Vector)和XIAP過表達載體(XIAP)購自上海吉凱基因公司。胃癌細胞接種于24孔板，將XIAP-GV358慢病毒轉(zhuǎn)染HGC27細胞，48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達情況；用嘌呤霉素(0.3 mg/L)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株；以未轉(zhuǎn)染(Control組)和Vector組為對照，Western blotting鑒定XIAP表達。過表達實驗分為Vector組、Vector+DADS組、XIAP組、XIAP+DADS組。Vector組、XIAP組未用DADS處理，Vector+DADS組、XIAP+DADS組DADS(30 mg/L)處理24 h。

1.3 Western blotting

用RIPA溶液4 ℃裂解細胞，提取蛋白，BCA法檢測蛋白水平，各組取等量樣本凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，置于脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，加ECL發(fā)光液，X片曝光、顯影、定影。掃描灰度值，以β-actin作為內(nèi)對照計算相對蛋白表達水平。

1.4 MTT檢測

96孔板中接種各組細胞，每組設(shè)置6個重復(fù)孔，用DADS(30 mg/L)處理細胞24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液后置于培養(yǎng)箱2 h，酶聯(lián)免疫檢測儀中測定OD450值。細胞增殖率(%)=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.5 平板克隆形成實驗

6孔板中接種各組細胞，每孔200個細胞，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，處理細胞后放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)14天，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，自然風(fēng)干后用結(jié)晶紫染色?？寺⌒纬陕?%)=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.6 遷移和侵襲實驗

在Transwell上層小室接種各組細胞，將1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)加入下室，DADS(30 mg/L)處理細胞24 h后，拭去小室上層膜表面的細胞，用4%多聚甲醛溶液固定小室下表面的細胞，結(jié)晶紫溶液(0.1%)染色。倒置顯微鏡下隨機選擇4個高倍視野，計數(shù)遷移的細胞數(shù)量，計算平均值。進行侵襲實驗前，將Matrigel基質(zhì)膠鋪在小室上層膜表面，之后的實驗步驟與上述遷移實驗相同。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 XIAP過表達胃癌HGC27細胞株的建立及鑒定

HGC27細胞轉(zhuǎn)染慢病毒48 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察到細胞狀態(tài)良好，熒光顯微鏡下觀察到GFP熒光信號強，提示XIAP-GV358慢病毒載體轉(zhuǎn)染細胞效率較高(圖1A)；繼續(xù)用嘌呤霉素篩選細胞株2周，Western blotting鑒定Control組、Vector組、XIAP組的XIAP蛋白表達情況，結(jié)果顯示XIAP組蛋白水平明顯高于Control和Vector組(P<0.05；圖1B)，成功建立XIAP穩(wěn)定過表達HGC27細胞株。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染HGC27細胞及Western blotting檢測XIAP表達A為光學(xué)顯微鏡下(左)和熒光顯微鏡下(右)觀察慢病毒轉(zhuǎn)染的HGC27細胞；B為Western blotting檢測XIAP表達。a為P<0.05，與Control組和Vector組比較。

2.2 DADS對胃癌HGC27細胞XIAP表達的影響

Vector+DADS組XIAP蛋白水平低于Vector組(P<0.05；圖2)；XIAP+DADS組XIAP蛋白水平高于Vector+DADS組，但低于XIAP組(P<0.05)。

圖2 DADS對胃癌HGC27細胞XIAP表達的影響1為Vector組；2為Vector+DADS組；3為XIAP組；4為XIAP+DADS組。a為P<0.05，與Vector組比較；b為P<0.05，與Vector+DADS組和XIAP組比較。

2.3 DADS對XIAP過表達胃癌HGC27細胞增殖及克隆的影響

Vector+DADS組細胞增殖率呈時間依賴性下降(P<0.05；表1)；與Vector組比較，Vector+DADS組增殖率、克隆形成率降低，而XIAP組增殖率、克隆形成率升高；XIAP+DADS組細胞增殖率、克隆形成率高于Vector+DADS組，低于XIAP組(P<0.05；表1和圖3)。

2.4 DADS對XIAP過表達胃癌HGC27細胞遷移及侵襲的影響

與Vector組比較，細胞遷移、侵襲數(shù)量Vector+DADS組明顯減少，XIAP組增加(P<0.05)；XIAP+DADS組細胞遷移、侵襲數(shù)量高于Vector+DADS組，低于XIAP組(P<0.05；表2和圖4)。

表1 DADS對XIAP過表達HGC27細胞增殖的影響 單位：%

圖3 DADS對XIAP過表達HGC27細胞克隆形成的影響1為Vector組；2為Vector+DADS組；3為XIAP組；4為XIAP+DADS組。a為P<0.05，與Vector組比較；b為P<0.05，與Vector+DADS組和XIAP組比較。

表2 DADS對XIAP過表達HGC27細胞遷移和侵襲的影響 單位：個

圖4 DADS對XIAP過表達HGC27細胞遷移及侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，40×)

3 討 論

胃癌的早期診斷和治療可提高患者生存率[6]，但因復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差[7]。研究干預(yù)胃癌發(fā)生的藥物對于胃癌防治具有重要意義。

XIAP表達與胃癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，癌組織XIAP表達較高的患者預(yù)后較差，說明XIAP與胃癌臨床進展密切相關(guān)[8]。本實驗結(jié)果顯示，XIAP過表達增強胃癌HGC27細胞增殖和遷移侵襲能力，證實XIAP表達增高可促進胃癌細胞惡性表型。Li等[8]報道，siRNA下調(diào)XIAP表達可抑制HGC27細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡。Sun等[9]發(fā)現(xiàn)XIAP是MicroRNA-509-3p作用靶點，后者抑制胃癌HGC27和MKN45細胞遷移和侵襲能力。上述研究表明，下調(diào)XIAP是抗胃癌增殖和轉(zhuǎn)移潛能的有效策略。

DADS可干預(yù)多條信號通路、發(fā)揮腫瘤防治作用，它通過下調(diào)癌基因、上調(diào)抑癌基因誘導(dǎo)細胞周期阻滯，抑制增殖[10]。DADS誘導(dǎo)G2/M期阻滯可抑制胃癌干細胞增殖[11]。本實驗室通過差異蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，DADS影響LIMK1、RORα、XIAP等多個基因表達[5]，證實DADS下調(diào)LIMK1、上調(diào)RORα可誘導(dǎo)G2/M期阻滯、抑制胃癌細胞增殖[3]。本實驗在證實過表達XIAP促細胞增殖的基礎(chǔ)上，進一步明確DADS通過下調(diào)過表達細胞XIAP表達、抑制胃癌HGC27細胞增殖。文獻報道，XIAP抑制劑可干預(yù)JAK/STAT、PI3K/Akt、p53、p38等信號通路，發(fā)揮抗胃癌生長的作用[12]；大麻酚下調(diào)XIAP表達可抑制胃癌細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡[13]。XIAP參與多條信號通路的調(diào)節(jié)，DADS可能通過抑制XIAP表達影響其介導(dǎo)的促胃癌細胞增殖的信號通路。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor，TGF-β)可通過非Smad依賴性信號通路誘導(dǎo)腫瘤細胞由上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)，使腫瘤細胞獲得轉(zhuǎn)移能力[14]。XIAP介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)食管癌細胞EMT，增強其遷移侵襲能力[15]。本實驗結(jié)果證實，XIAP過表達可增強HGC27細胞遷移侵襲能力，而DADS下調(diào)過表達細胞XIAP的表達、降低細胞遷移和侵襲能力。前期研究證實，DADS通過抑制EMT降低胃癌細胞遷移侵襲能力[3]；DADS下調(diào)TGF-β可抑制EMT相關(guān)信號通路分子Rac1和β-catenin表達[16]。DADS可能通過下調(diào)XIAP抑制TGF-β誘導(dǎo)胃癌細胞EMT，從而使XIAP介導(dǎo)的細胞遷移侵襲能力降低。