范玉梅，趙明，趙媛，劉俊英

作者單位：周口市中心醫(yī)院消化科，河南 周口 466330

肝纖維化（liver fibrosis）是多種原因引起的慢性肝損傷所致的病理改變，其最終可致肝硬化、肝功能紊亂，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過(guò)度沉積［1］。研究表明肝星狀細(xì)胞（HSCs）的激活在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用，HSCs活化可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的增加，這是肝纖維化形成并最終導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭的主要原因；因此抑制HSCs 活化、增殖，進(jìn)而減少ECM 合成是目前阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要策略［2］。研究顯示多種中藥可發(fā)揮抗肝纖維化作用，通過(guò)直接作用于HSCs實(shí)現(xiàn)［3］。黑老虎根是五味子科五味子屬植物的干燥根，其具有抗氧化、抗炎等作用［4］。有研究表明黑老虎根提取物可減少脂質(zhì)在肝臟的沉積、減輕過(guò)氧化損傷，對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)和保護(hù)肝臟的作用［5］。黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）細(xì)胞的增殖具有抑制作用［6］。以上研究表明黑老虎根提取物可能具有抗纖維化作用。miR-193 在實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠［7］、肝癌［8］中低表達(dá)，其是否參與對(duì)HSCT6 細(xì)胞的調(diào)控還未見(jiàn)研究。因此，本研究通過(guò)研究黑老虎根提取物對(duì)HSC-T6 增殖、凋亡的影響以及miR-193 過(guò)表達(dá)在其中的作用，為黑老虎根提取物的臨床應(yīng)用以及miR-193的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料研究起止時(shí)間為2018年10月至2019年12 月。大鼠HSC-T6 細(xì)胞（CL-0116）購(gòu)自武漢普諾賽，黑老虎根提取物購(gòu)自西安金綠，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（E-CK-A351）購(gòu)自武漢Elabsscience 公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK-8）試劑盒（C0039）、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（P0012）、凋亡試劑盒（C1062L）、定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)（RT-qPCR）所用試劑盒（D7260）購(gòu)自上海碧云天。細(xì)胞增殖核抗原（Ki67）（ab16667）、活化胱天蛋白酶-3（Cleaved caspase-3）（ab32042）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（ab9485）、二抗（ab6728）購(gòu)自abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)液選擇RP?MI-1640（含10%小牛血清），分別用1.5 mg/L、3.0 mg/L、6.0 mg/L黑老虎根提取物處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSC-T6細(xì)胞，記為實(shí)驗(yàn)1、2、3組；另選取未加黑老虎根提取物的HSC-T6細(xì)胞作為對(duì)照組。將miR-NC、miR-193轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞中，記為miR-NC組、miR-193組；將anti-miR-NC、anti-miR-193 分別轉(zhuǎn)染至HSC-T6 細(xì)胞中再用6.0 mg/L黑老虎根提取物處理，記為實(shí)驗(yàn)3+an?ti-miR-NC組、實(shí)驗(yàn)3+anti-miR-193組。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSC-T6 細(xì)胞周期收集培養(yǎng)48 h 的“1.2”中的各組HSC-T6 細(xì)胞（2×105個(gè)），磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后離心去上清，乙醇（70%）固定（-20 ℃，4 h），離心（350g，5 min），PBS洗滌，加入碘化啶（PI）（濃度為50 mg/L）與RNaseA（孵育15 min），上機(jī)測(cè)定，分析各組HSC-T6 細(xì)胞G0-G1期、S期、G2-M期細(xì)胞比例。

1.4 CCK-8 檢測(cè)HSC-T6 細(xì)胞存活率收集培養(yǎng)48 h 的“1.2”中各組HSC-T6 細(xì)胞，加入10μL CCK-8試劑/孔，孵育2 h 后，酶標(biāo)儀測(cè)定各組HSC-T6 細(xì)胞吸光度（A）值（490 nm 處）。細(xì)胞存活率（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)HSCT6 細(xì)胞Ki67、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)提取HSC-T6 細(xì)胞總蛋白并對(duì)提取蛋白進(jìn)行定量（BCA法）。蛋白（50 μL）行SDS-PAGE 電泳，濕法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，封閉1 h；加入Ki67、Cleaved caspase-3、GAPDH（內(nèi)參）抗體，Ki67、Cleaved caspase-3 稀釋比為1∶1 000，GAPDH 稀釋比為1∶5 000；過(guò)夜后添加二抗培養(yǎng)1 h，稀釋比為1∶5 000，測(cè)定Ki67、Cleaved caspase-3蛋白灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集培養(yǎng)48 h 的“1.2”中各組HSC-T6細(xì)胞，PBS漂洗2次，Annexin VFITC 試劑盒處理HSC-T6 細(xì)胞，避光孵育10 min，上機(jī)檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-193表達(dá)水平收集培養(yǎng)48 h的“1.2”中各組HSC-T6細(xì)胞，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-193 以U6 為內(nèi)參，miR-193：正向引物AACTGGCCTACAAAGTC-3， 反 向 引 物 GTG?CAGGGTCCGAGGT。U6：正向引物GCTTCGGCAG?CACATATACTAAAAT，反 向 引 物 CGCTTCAC?GAATTTGCGTGTCAT。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行此研究數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑老虎根提取物對(duì)HSC-T6 細(xì)胞細(xì)胞周期分布與對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1 組相比，實(shí)驗(yàn)2、實(shí)驗(yàn)3 組G0-G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低，且呈濃度依賴性（均P<0.05），而各組G2-M 期細(xì)胞所占比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

表1 黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞周期的影響/（%，±s）

表1 黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞周期的影響/（%，±s）

注：①與對(duì)照組相比，P<0.05。②與實(shí)驗(yàn)1 組相比，P<0.05。③與實(shí)驗(yàn)2組相比，P<0.05。

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2.2 黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6 細(xì)胞活性的影響CCK-8 及Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1 組相比，實(shí)驗(yàn)2、3 組細(xì)胞存活率降低，Ki67 表達(dá)水平降低，且呈濃度依賴性（P<0.05），見(jiàn)圖1，表2。

圖1 黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞Ki67蛋白表達(dá)的影響

表2 黑老虎根提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞細(xì)胞活性及Ki67的影響/±s

表2 黑老虎根提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞細(xì)胞活性及Ki67的影響/±s

注：Ki67為細(xì)胞增殖核抗原。①與對(duì)照組相比，P<0.05。②與實(shí)驗(yàn)1組相比，P<0.05。③與實(shí)驗(yàn)2組相比，P<0.05。

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2.3 黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6 凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)及Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1 組相比，實(shí)驗(yàn)2、3 組細(xì)胞凋亡率升高，Cleaved caspase-3 表達(dá)水平升高，且呈濃度依賴性（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 黑老虎提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞凋亡的影響/±s

表3 黑老虎提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞凋亡的影響/±s

注：Cleaved caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3。①與對(duì)照組相比，P<0.05。②與實(shí)驗(yàn)1組相比，P<0.05。③與實(shí)驗(yàn)2組相比，P<0.05。

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2.4 黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6 中miR-193 表達(dá)的影響RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（0.92±0.04）和實(shí)驗(yàn)1 組（0.93±0.05）相比，實(shí)驗(yàn)2、3 組miR-193 表達(dá)水平（1.65±0.05、2.69±0.07）升高，且呈濃度依賴性（F=727.26，P<0.001）。

2.5 過(guò)表達(dá)miR-193對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞周期、細(xì)胞活性及凋亡的影響與miR-NC 組相比，miR-193 組miR-193 表達(dá)水平升高，G0-G1 期細(xì)胞比例升高，S 期細(xì)胞比例降低（均P<0.05）；細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，Ki67表達(dá)水平降低，Cleaved caspase-3表達(dá)水平升高（均P<0.05），見(jiàn)圖2，表4。

圖2 miR-193對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞凋亡（2A）、細(xì)胞活性（2B）的影響 圖3 抑制miR-193可逆轉(zhuǎn)黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞凋亡（3A）及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（3B）的影響

表4 過(guò)表達(dá)miR-193對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞周期、細(xì)胞活性及凋亡的影響/±s

表4 過(guò)表達(dá)miR-193對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞周期、細(xì)胞活性及凋亡的影響/±s

注：Ki67為細(xì)胞增殖核抗原，Cleaved caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3。

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2.6 抑制miR-193 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6 細(xì)胞周期、細(xì)胞活性及凋亡的影響與實(shí)驗(yàn)3+anti-miR-NC 組相比，實(shí)驗(yàn)3+antimiR-193 組細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高（均P<0.05）；Ki67表達(dá)水平升高，Cleaved caspase-3表達(dá)水平降低（均P<0.05），見(jiàn)圖3，表5。

表5 抑制miR-193可逆轉(zhuǎn)黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞周期、細(xì)胞活性及凋亡的影響/±s

表5 抑制miR-193可逆轉(zhuǎn)黑老虎根提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞周期、細(xì)胞活性及凋亡的影響/±s

注：Ki67為細(xì)胞增殖核抗原，Cleaved caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3。

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3 討論

肝纖維化是肝臟慢性炎癥進(jìn)一步向肝硬化、肝癌發(fā)展的重要環(huán)節(jié)；而肝纖維化的形成是由多細(xì)胞，多因子共同參與的復(fù)雜病理過(guò)程［9-11］。HSCs 是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的重要來(lái)源，其可合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，并促進(jìn)肝細(xì)胞的正常增殖，肝星狀細(xì)胞激活是肝纖維化形成的重要原因之一［12］，因此，抗纖維化治療可以HSCs 為靶向細(xì)胞，研究顯示，垂盆草總黃酮可通過(guò)Smads通路對(duì)HSCs細(xì)胞活化抑制發(fā)揮抗肝纖維化作用［13］；GATA6 抑制HSC 活化抗肝纖維化［14］。以上研究均佐證HSCs在抗肝纖維化中的作用。

近年來(lái)研究表明中藥能夠多途徑，多靶點(diǎn)作用于HSCs，誘導(dǎo)HSCs 凋亡、減少活化的HSCs，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用［3］，如烏蘭十三味湯可調(diào)節(jié)HSCs活化抑制肝纖維化［15］。黑老虎根來(lái)源于植物冷飯團(tuán)，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，已有研究表明黑老虎根提取物具有保護(hù)肝臟的作用［7］。此外，來(lái)自黑老虎根的二苯并環(huán)辛二烯木脂素和羊毛甾烷衍生物對(duì)叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的原代大鼠肝細(xì)胞損傷也具有保護(hù)作用［16］。本研究用不同濃度的黑老虎根提取物處理肝星狀細(xì)胞HSC-T6，研究黑老虎根提取物對(duì)HSC-T6 增殖、凋亡的影響，結(jié)果顯示，3.0 mg/L、6.0 mg/L黑老虎根提取物處理的HSC-T6中，G0-G1期細(xì)胞比例較未經(jīng)處理HSC-T6細(xì)胞高，而S期細(xì)胞比例則降低，提示3.0 mg/L、6.0 mg/L 濃度的黑老虎根提取物可促使HSC-T6 細(xì)胞S 期阻滯，通過(guò)調(diào)控HSC-T6 細(xì)胞生長(zhǎng)周期控制細(xì)胞增殖進(jìn)程。研究顯示HSC-T6 細(xì)胞存活率、Ki67 表達(dá)降低，而凋亡率、cleaved caspase-3 升高，提示3.0 mg/L、6.0 mg/L 濃度的黑老虎根提取物發(fā)揮抑制HSC-T6 細(xì)胞增殖、促進(jìn)HSC-T6 細(xì)胞凋亡。而1.5 mg/L 黑老虎根提取物處理的HSC-T6 中各指標(biāo)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明濃度過(guò)低的黑老虎根提取物對(duì)HSC-T6 細(xì)胞存活、凋亡無(wú)作用。

研究表明miRNA 可調(diào)控HSCs 的活化、增殖、凋亡等，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［17］，其中miR-193 在肝纖維化過(guò)程中表達(dá)水平降低［18］。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）是HSCs 活化的標(biāo)志性分子，研究報(bào)道m(xù)iR-193 能抑制活化型HSCs 中肝纖維化相關(guān)基因α-SMA 的表達(dá)［19］。miR-193 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Beta（TGF-β）依賴性調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的一部分，可控制肝纖維化中的細(xì)胞外基質(zhì)基因［20］。miR-193 在實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠中低表達(dá)，miR-193過(guò)表達(dá)可降低肝損傷大鼠α-SMA 蛋白表達(dá)［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-193過(guò)表達(dá)可升高G0-G1期細(xì)胞比例，并降低S期細(xì)胞比例；同時(shí)降低HSC-T6細(xì)胞存活率、Ki67表達(dá)，并升高細(xì)胞凋亡率與cleaved caspase-3。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-193可調(diào)控HSC-T6細(xì)胞周期、抑制HSC-T6細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且本研究還發(fā)現(xiàn)3.0 mg/L、6.0 mg/L黑老虎根提取物處理的HSC-T6細(xì)胞中miR-193表達(dá)水升高；而抑制miR-193表達(dá)逆轉(zhuǎn)了黑老虎根提取物對(duì)HSC-T6細(xì)胞抑增殖、促凋亡作用。

綜上所述，黑老虎根提取物可抑制HSC-T6 細(xì)胞惡性化增殖，可能與黑老虎根提取物上調(diào)miR-193 表達(dá)相關(guān)；可為肝纖維化的治療提供新方法和新靶點(diǎn)。