雷 剛，周坤華，陳學(xué)軍，黃月琴，袁欣捷，方 榮

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，江西 南昌 330200）

0 引言

辣椒（Capsicum annuum L.）是我國栽培面積最大的蔬菜作物之一，年種植面積超過210萬hm2，總 產(chǎn) 量6400多 萬t［1］。辣 椒 果 實(shí) 中 含 有 豐 富 的辣椒素、辣椒堿、維生素、辣椒色素、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、糖和礦物質(zhì)等多種功能性成分，除了應(yīng)用在食品行業(yè)外，還被用于飼料、化妝品、工業(yè)染料、醫(yī)藥及軍事等行業(yè)［2-3］。辣椒屬于常異花授粉植物，具有較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，F(xiàn)1代雜交種子比常規(guī)種早期增產(chǎn)達(dá)50%左右，全生育期產(chǎn)量增加30%～50%［4］。但目前人工雜交制種不僅存在成本高、授粉效率低、種子純度難以保證等問題，而且親本材料容易流失［5-7］，利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（cytoplasmic male sterile，CMS）進(jìn)行雜交制種可有效解決這一難題。

有關(guān)辣椒CMS小孢子敗育細(xì)胞學(xué)的研究已有諸多報(bào)道，小孢子敗育的時(shí)期因材料的不同而異，敗育現(xiàn)象從造孢細(xì)胞時(shí)期之后每個(gè)階段都有發(fā)生［8］。掌握敗育發(fā)生的時(shí)期和成因?qū)τ谛坌圆挥霓D(zhuǎn)育和在生產(chǎn)上的應(yīng)用意義重大。本研究通過對辣椒CMS B351A及其保持系B351B的小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)形態(tài)進(jìn)行比較和鑒定，確定不育發(fā)生的時(shí)期，推測其發(fā)生的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，進(jìn)而為B351A花藥敗育發(fā)生的分子生物學(xué)研究和不育性狀育種應(yīng)用提供參考和理論指導(dǎo)；同時(shí)，對小孢子發(fā)育時(shí)期與對應(yīng)花蕾外觀形態(tài)特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，旨在確定從花蕾的形態(tài)特征來判斷其小孢子發(fā)育時(shí)期的標(biāo)準(zhǔn)，為辣椒小孢子培養(yǎng)接種材料和分子生物學(xué)研究材料的便捷選取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)苯芳?xì)胞質(zhì)雄性不育系材料B351A（S/rfrf）及其保持系B351B（N/rfrf），由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所茄果類蔬菜課題組發(fā)現(xiàn)并選育。B351A的細(xì)胞質(zhì)來源于2007年在試驗(yàn)田發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育植株，其花藥為紫色、干癟皺縮，開裂后無花粉，柱頭外露，雌蕊發(fā)育正常；其保持系B351B的花藥也為紫色、飽滿，開裂后花粉量大（圖1）。

圖1 辣椒雄性不育材料B351A（A）及其保持系材料B351B（B）的花器官形態(tài)

材料于2020年2月中旬播種，每個(gè)材料播100粒種子，苗期晝夜溫度設(shè)為（28±2）℃/（15±2）℃，光周期12 h，光照強(qiáng)度180 μmol/（m2·s），相對濕度（65±5）%。3月下旬定植于試驗(yàn)溫室，管理同常規(guī)生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花蕾的測量及形態(tài)描述 于盛花期早上8：00～9：00采集不同大小（縱徑2.00～8.00 mm）的花蕾?；ɡ俚臏y量采用游標(biāo)卡尺，分別測量花蕾縱徑，即花蕾基部至花冠伸出點(diǎn)/花冠頂端的長度；橫徑，花萼中部位置橫切面的直徑；花冠長度，花冠漏出花萼部分的長度。對花蕾外觀形態(tài)，如花萼形態(tài)、花冠形態(tài)、色澤等進(jìn)行描述。

1.2.2 花藥小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察 （1）固定：取辣椒雄性不育材料B351A及其保持系B351B經(jīng)過測量的花蕾，用鑷子小心剝?nèi)セㄝ?、花冠露出花藥后迅速置于電鏡固定液中（2.5%戊二醛，0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH值為7.0～7.5）固定，并用真空泵抽氣直至沉底，室溫放置2 h，后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱，隨后用0.1 mol/L磷酸緩沖液PB（pH值為7.4）漂洗3次，每次15 min。

（2）后固定：用1.0%的鋨酸·0.1 mol/L磷酸緩沖液PBS（pH值為7.4）室溫固定5 h，隨后用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值為7.4）漂洗3次，每次15 min。

（3）脫水與透明：將固定好的組織分別用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精進(jìn)行脫水，每次1 h。將脫水后的組織材料置于無水乙醇∶丙酮為3∶1、1∶1和1∶3（v∶v）的溶液中分別透明0.5 h，最后置于丙酮溶液中1 h。

（4）滲透與包埋：利用丙酮∶812包埋劑=3∶1（v∶v）滲 透3 h，丙 酮∶812包 埋 劑=1∶1（v∶v）滲透過夜，丙酮∶812包埋劑=1∶3（v∶v）滲透3 h，純812包埋劑滲透6 h；將純812包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過夜，隨后轉(zhuǎn)60 ℃烤箱聚合48 h。

（5）切片：采用徠卡的超薄切片機(jī)Leica UC7切片，切片厚度1～2 μm。

（6）染色：將甲苯胺藍(lán)染液放入烤箱60 ℃加熱，將切片置于染液中浸染2 min，隨后用蒸餾水洗2 min，95%酒精分化，在光鏡下控制顏色，烤干后用中性樹膠封片。最后采用日立HT7700電子透射電鏡進(jìn)行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不育系與保持系小孢子發(fā)育過程的細(xì)胞學(xué)形態(tài)觀察比較

2.1.1 花粉母細(xì)胞時(shí)期（S1） 孢原細(xì)胞經(jīng)過分裂形成了纖維層、中層、絨氈層和花粉母細(xì)胞。絨氈層細(xì)胞位于花藥壁的最內(nèi)層，排列整齊緊密，染色很深，造孢細(xì)胞則位于絨氈層的內(nèi)側(cè)，體積較大（圖2A）。此時(shí)期，不育系與保持系花藥在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)上沒有明顯的差異（圖2B）。

2.1.2 四分體時(shí)期（S2） 此時(shí)保持系花藥中層細(xì)胞消失，其他各層細(xì)胞層次分明，絨氈層細(xì)胞體積大，細(xì)胞核大且著色深；花粉母細(xì)胞經(jīng)過 2次分裂形成染色較深的胼胝質(zhì)包裹的四面體結(jié)構(gòu)（圖2C）。而不育系花藥室內(nèi)未見四分體結(jié)構(gòu)，可見一些形狀不規(guī)則的花粉母細(xì)胞，中層細(xì)胞還清晰可見，部分絨氈層細(xì)胞明顯液泡化且體積較大，擠壓花藥室，有的絨氈層細(xì)胞已經(jīng)降解成為深色條塊（圖2D）。

2.1.3 單核期-單核靠邊期（S3） 保持系小孢子細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)液泡，細(xì)胞核被擠壓靠近細(xì)胞壁；絨氈層細(xì)胞已經(jīng)開始退化（圖2E）。此時(shí)不育系絨氈層已經(jīng)完全降解成為深色條帶；花藥室受擠壓變得狹小，未完成減數(shù)分裂的花粉母細(xì)胞也完全降解，與絨氈層細(xì)胞降解殘?jiān)尺B在一起形成深色條帶（圖2F）。

2.1.4 成熟花粉粒時(shí)期（S4） 此時(shí)保持系的花粉粒變的很圓，著色深，有的花粉粒可以看到萌發(fā)孔；絨氈層細(xì)胞幾乎全部降解，僅有部分細(xì)胞殘留物在花藥室內(nèi)壁上（圖2G）。而不育系花藥室內(nèi)看不到成熟的花粉粒，僅可見解體的花粉母細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞粘連在一起，形成著色很深的條帶（圖2H）。

圖2 辣椒胞質(zhì)雄性不育系B351A和保持系B351B小孢子發(fā)育過程

2.2 B351A和B351B小孢子發(fā)育各時(shí)期對應(yīng)花蕾外觀特征

通過電鏡觀察不同大小花蕾對應(yīng)小孢子的發(fā)育時(shí)期，從表1可見，小孢子發(fā)育的時(shí)期與花蕾的縱徑、橫徑、花冠長度及花萼、花冠色澤和狀態(tài)有密切的關(guān)系。無論是不育系還是保持系，在花粉母細(xì)胞時(shí)期花萼緊緊包裹花冠；四分體時(shí)期花萼微微張開，漏出淺綠色的花冠，從S1到S2花蕾縱徑增加不明顯，但橫徑增加相對較大；單核靠邊期（S3）花萼處于半抱合狀態(tài)，花冠長度接近花萼長度，從S2到S3花蕾縱徑和橫徑都明顯增加；花粉成熟期花萼向外張開，花冠露出部分達(dá)花萼長度的1/2，中部鼓起，顏色黃白色，從S3至S4花蕾縱徑和花冠長度增加最為明顯，增加的長度主要是花冠長度增加所致，橫徑變化不明顯（表1）。

表1 花藥不同發(fā)育時(shí)期對應(yīng)花蕾的外觀形態(tài)和參數(shù)

3 討論與結(jié)論

3.1 辣椒胞質(zhì)雄性不育系B351A小孢子發(fā)生敗育的時(shí)期

在被子植物中，一般單子葉植物小孢子敗育多發(fā)生在雙核期或靠近雙核期，而雙子葉植物多發(fā)生在四分體時(shí)期或小孢子早期［9］。就辣椒而言，花粉敗育發(fā)生在花粉母細(xì)胞時(shí)期［10-13］、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期［14-17］、四分體時(shí)期［18-22］、單核期［23-25］等的都有相關(guān)報(bào)道，這可能是基因型和不育類型的差異所致。本研究發(fā)現(xiàn)，在花粉母細(xì)胞時(shí)期，2個(gè)材料花藥的細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒有明顯的差異（圖2A、2B），但在四分體時(shí)期，B351A的絨氈層細(xì)胞退化明顯，花藥室內(nèi)無四分體形成；隨著花藥繼續(xù)發(fā)育，花粉母細(xì)胞逐漸發(fā)生分解、退化（圖2F、2H），最終導(dǎo)致無小孢子產(chǎn)生而發(fā)生敗育。因此，不育系B351A小孢子敗育發(fā)生在花粉母細(xì)胞時(shí)期至四分體時(shí)期之間，即花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，這與吳鶴鳴等［14-17］的研究結(jié)果相似，皆是在形成四分體前絨氈層細(xì)胞的異?；蛱崆敖到猓瑢?dǎo)致無四分體或產(chǎn)生畸形的四分體結(jié)構(gòu)而引起敗育。絨氈層是花藥壁的最內(nèi)層結(jié)構(gòu)，毗鄰小孢子，為小孢子發(fā)育提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)、生長素和酶，并適時(shí)降解，為小孢子發(fā)育提供空間。絨氈層細(xì)胞與高等植物的花粉發(fā)育有著密切的關(guān)系，其結(jié)構(gòu)異常，提早或延后降解都會導(dǎo)致花粉敗育［26］。本研究中，B351B的絨氈層在四分體時(shí)期后開始降解，到花粉成熟期已完全降解，而B351A花藥絨氈層在減數(shù)分裂期就提前降解，解體的細(xì)胞包裹著花粉母細(xì)胞，導(dǎo)致花粉母細(xì)胞營養(yǎng)不能減數(shù)分裂形成四分體結(jié)構(gòu)，沒有小孢子產(chǎn)生而發(fā)生敗育。

3.2 辣椒小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾外觀形態(tài)的關(guān)系

前人研究發(fā)現(xiàn)，辣椒花蕾色澤、縱徑、橫徑，花藥色澤、長、寬，花萼長及花瓣長等外觀指標(biāo)和形態(tài)特征與小孢子發(fā)育時(shí)期有密切關(guān)系，可作為通過外觀形態(tài)判斷小孢子發(fā)育時(shí)期，進(jìn)行田間取樣的依據(jù)［27-29］。本研究對辣椒CMS B351A及其保持系B351B的小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾外觀形態(tài)特征進(jìn)行了分析，研究結(jié)果表明，小孢子各發(fā)育時(shí)期與花蕾的一些外部形態(tài)特征關(guān)系密切?；ǚ勰讣?xì)胞時(shí)期或之前，花萼緊緊包裹花冠是最明顯的特征；從花粉母細(xì)胞時(shí)期到四分體時(shí)期，花蕾橫徑增加最為明顯，可能是此時(shí)花藥縱向生長速度較快；四分體到單核期，花蕾縱徑和橫徑都明顯增加；當(dāng)花冠長度接近花萼長度時(shí)，小孢子處于單核靠邊期，但單核靠邊期之后，花蕾橫徑幾乎沒變化，花冠的快速伸長導(dǎo)致了縱徑大幅的增加。因此，可以根據(jù)花萼狀態(tài)判斷是否處于花粉母細(xì)胞期前后，根據(jù)花冠長與花蕾縱徑比判斷是否處于單核靠邊期，這與張菊平等［27-30］報(bào)道的對應(yīng)花蕾狀態(tài)的小孢子發(fā)育有些許差異，這可能與所用的材料基因型不同有關(guān)。筆者認(rèn)為，辣椒花蕾大小和外觀形態(tài)不僅受基因型的影響，受環(huán)境影響也很大，研究結(jié)果對供試材料具有一定的指導(dǎo)意義，但不具有普適性。