羅黎明，李龍雪，舒 坤，肖素云，吳鐘睿，洪 滔，劉志勇

(江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心，330004，南昌)

0 引言

一些對水代謝或血液循環(huán)有益的中藥通常具有利尿作用，同時加工技術(shù)的不同會使這些中藥可能具有不同靶點甚至多靶點的利尿作用[1]，由于傳統(tǒng)利尿西藥有一定的副作用，因此，尋找具有利尿作用的中草藥成為越來越受歡迎的研究方向[2-4]。薏苡仁是國內(nèi)非常受歡迎的藥食兩用物質(zhì)，它具有良好的除濕作用，用作治療濕證相關(guān)疾病的藥物，法薏仁是根據(jù)中藥炮制理論，將薏苡仁經(jīng)浸、蒸、炒等多種炮制方法組合加工而成的薏苡仁的炮制品，它的藥性由涼轉(zhuǎn)平，對健脾利濕有很好的保健作用[5-6]。 薏苡仁及其粗提物的藥理特性以前已有研究，然而，在正常條件下，薏苡仁，尤其是法薏仁的利尿活性和利尿機制，尚未在正常大鼠中進(jìn)行系統(tǒng)研究。因此，迫切需要弄清兩者的利尿活性和利尿機制的區(qū)別，以期為臨床用藥提供指導(dǎo)。本研究的目的是評估薏苡仁及其新炮制品法薏仁在7 d內(nèi)對正常大鼠的利尿活性，通過給藥后不同時間點(1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h、110 h、134 h和158 h)測量尿量、尿電解質(zhì)濃度(Na+、K+、Ca2+、Cl-)和pH值，檢測尿中Na+-K+ATPase、心房肽素(ANP)、抗利尿激素(ADH)、醛固酮(ALD)以及AQPs水平。

1 材料

1.1 儀器

大鼠代謝籠(山東新華實驗動物設(shè)備有限公司)；全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；PH S-3C型精密pH計(上海雷磁儀器廠)；尿液離子檢測Beckman couler AU2700(美國)。

1.2 藥品與試劑

生薏苡仁粉，法薏仁粉，均由江西景德中藥有限公司提供；呋塞米片(上海朝暉制藥公司，批號：20191021)；戊巴比妥鈉(德國默克公司，批號：K2208)；大鼠ADH抗利尿激素酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號：20190513)、大鼠ALD醛固酮試劑盒(批號：20191027)、大鼠ANP心房鈉尿肽ELISA試劑盒(批號：20190922)均購自上海赫澎生物科技有限公司。

1.3 受試動物

雄性無特定病原體級SD大鼠，體重范圍為180～220 g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(贛)2018―0003。在江西中醫(yī)藥大學(xué)屏障實驗系統(tǒng)內(nèi)組織實施，系統(tǒng)使用許可為SYXK(贛)2017―0004。所有動物操作符合實驗動物倫理要求,并獲得江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的審批。

2 方法

2.1 試驗?zāi)Ｐ椭苽渑c給藥安排

大鼠先行1W的檢疫，檢疫合格后按下述方法進(jìn)行水負(fù)荷篩選：每只大鼠按2.5 mL/100g灌蒸餾水，留置2 h的尿量，尿量大于給水量40%的實驗鼠判為模型復(fù)制成功。將水負(fù)荷模型復(fù)制成功的40只大鼠，按體重、尿量隨機分為生理鹽水模型組、呋塞米陽性對照組(20 mg/kg)、生薏苡仁組(1 000 mg/kg)、法薏仁高(1 000 mg/kg)、法薏仁低劑量組(500 mg/kg)每組8只。實驗前夜停止喂食16 h，不禁水，次日實驗時各組大鼠按4 mL/100g給予1%NaCL溶液，制備鹽水負(fù)荷模型。模型復(fù)制成功20 min后，按1 mL/100g口服給予相應(yīng)劑量的藥物。

2.2 指標(biāo)檢測

各組大鼠給藥后，立即放入代謝籠中，每1 h、2 h、3 h、4 h、6 h收集1次尿液，共計5次，測量各時間點的尿量，檢測各組大鼠各時間點尿液的pH和鈉氯鉀鈣的量，計算離子濃度。尿液收集完成后以3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，搜集血樣，3 000 r/min(離心半徑：6 cm)進(jìn)行10 min離心，獲取上層血清對照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定各組大鼠血清樣本中醛固酮、心房鈉尿肽等的含量，處死大鼠后，取出腎臟和脾，剪取腎髓質(zhì)和脾，各置1.5 mL離心管中-80 ℃凍存待檢AQP1,2,3基因表達(dá)水平。

2.3 AQP1,2,3基因的表達(dá)

2.3.1 RNA 抽取和反轉(zhuǎn)錄 使用RNA extraction kit 抽提RNA后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA獲得cDNA存于-80 ℃冰箱。

2.3.2 熒光定量 PCR引物的設(shè)計和實時PCR 引物序列和PCR擴增反應(yīng)參照文獻(xiàn)[7]，內(nèi)參基因選擇 GAPDH。引物序列和反應(yīng)體系見表1和表2。

混合后實驗體系置于熒光定量PCR儀中反應(yīng)， 擴增反應(yīng)條件如下： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)；然后反應(yīng)體系由50 ℃到90 ℃ (每6 s增加1 ℃)；收集參考基因和目的基因的Ct值； 最后計算目的基因的相對表達(dá)水平，并按照Yang et al[8]實驗方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

表1 RT-qPCR 的引物序列

表2 PCR反應(yīng)體系

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，通過SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，選擇單因素方差分析(One way ANVOA)及LSD比較，結(jié)果中P<0.05表示經(jīng)統(tǒng)計學(xué)運算，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 實驗大鼠尿液量的變化

給藥后1 h和2 h生薏苡仁和法薏仁低、高劑量組和陽性對照組大鼠的尿量與模型組比較有所增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且陽性對照組利尿效果最明顯；給藥后3 h法薏苡仁各劑量組大鼠尿量較生薏苡仁和陽性組多，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；但在給藥后4 h和6 h后，各實驗組尿量減少，但高劑量法薏仁和生薏苡仁尿量與陽性組相當(dāng)，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。這表明薏苡仁不管是炮制前還是炮制后作用與呋塞米差不多。之后的每24 h的尿量，各實驗組和陽性組尿量均高于模型組，法薏仁高劑量的利尿作用在48 h、110 h、134 h時高于陽性對照組，生薏苡仁的利尿作用基本與法薏仁低劑量相當(dāng)。各組大鼠各時間點的尿量比較見圖1，各組大鼠的總尿量比較見圖1。

注：與模型組比較，*P<0.05

由圖1可知，與模型組比較，薏苡仁經(jīng)過炮制后法薏仁的利尿作用和呋塞米相當(dāng)，并且與對照組大鼠比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而炮制前的生薏苡仁雖然也具有利尿作用，但基本與法薏仁的低劑量的利尿作用相當(dāng)，表明炮制后的薏苡仁利尿作用較強。

3.2 實驗大鼠尿液pH酸堿度和Na+、K+、Ca2+、Cl-的變化

與模型組比較，薏苡仁和炮制品法薏仁和陽性對照組大鼠尿液中156 h 前Na+、Cl-、K+量無顯著改變，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但156 h 后，陽性對照組和法薏仁組的Na+、Cl-排出有顯著差異，表明薏苡仁的利尿作用初期未改變Na+、Cl-、K+的水平，但后期有促進(jìn)Na+、Cl-排出的作用。各組實驗大鼠尿液的酸堿度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

各組實驗大鼠尿液中Na+、K +、Ca2+、Cl-濃度及酸堿度pH比較見圖2和3。

圖2 各組大鼠尿液中pH比較(x±s，n=10)

圖3 各組大鼠尿液中Na+、K+、Ca2+、Cl-量比較(x±s，n=10)

3.3 實驗大鼠血清中ALD、ANP和ADH含量的變化

法薏仁高、低劑量組、生薏仁和陽性對照組大鼠血清中ANP含量與對照組比較均呈增加趨勢，法薏仁高、低劑量組和陽性對照組大鼠ALD含量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。法薏仁高、生薏仁組和陽性對照組大鼠抗利尿激素含量下降，差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)，提示法薏仁的利尿作用機制與大鼠血清中ANP的分泌增加、減少血漿ALD的含量有關(guān)，結(jié)果比較見表3。

3.4 大鼠腎AQP1,2,3的表達(dá)變化

水通道蛋白(Aquaporin)，又名水孔蛋白，是分布在細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，形成細(xì)胞膜 “孔道”，可影響水在細(xì)胞的進(jìn)出，陽性對照組和法薏仁高劑量AQP1表達(dá)水平明顯下降，且差異具有顯著性(P<0.05)，AQP2在陽性對照組和生薏仁組表達(dá)下降，且差異具有顯著性(P<0.05)，AQP3表達(dá)水平可見法薏仁高劑量組明顯下降，且差異具有顯著性(P<0.05)，反映出法薏仁和生薏仁對水通道蛋白的影響不一樣。

4 討論

薏苡仁是古老的藥食兩用，為歷代中醫(yī)最為常用的中藥之一，其薏苡仁性味歸經(jīng)：甘、淡、微寒，歸脾、胃、肺經(jīng)，薏苡仁具有利水滲濕，健脾止瀉，祛濕除痹，清熱排膿作用。法薏苡仁飲片屬于樟幫中藥炮制特色產(chǎn)品，是按照中藥炮制學(xué)理論,經(jīng)過浸制，蒸制和炒制等數(shù)種復(fù)制后所得的薏苡仁炮制品種，其性由涼轉(zhuǎn)微溫，具有較好的健脾祛濕等效果[8-9]。本實驗發(fā)現(xiàn)生薏仁和法薏仁高劑量和低劑量均能促進(jìn)尿的排出，但未發(fā)現(xiàn)生薏仁和法薏仁對尿液中K+的分泌與尿液酸堿pH有比較明顯的影響。

圖4 法薏仁對鹽水負(fù)荷的大鼠的水通道蛋白基因表達(dá)的影響

醛固酮ALD、心房鈉尿肽ANP、抗利尿激素ADH都可以影響尿液生成與排出，本實驗發(fā)現(xiàn)薏苡仁與呋塞米對ADH未見明顯影響；生薏仁、法薏仁和呋塞米可促進(jìn)ANP的分泌、減少血清ALD的含量。ANP分泌增加會抑制ALD的分泌，而ANP分泌增加及ALD減少均會促進(jìn)Na+和水的排泄，從而也解釋了法薏仁可增加鹽水負(fù)荷模型大鼠尿量與尿液中Na+、Cl-的排出，生薏仁和法薏仁對尿液pH和K+未見明顯影響。

存在于血液、腎臟、大腦等部位的水通道蛋白(Aquaporin，AQP)，具有選擇性的讓水分子通過的特性，其中AQP1,2,3,4與腎臟的尿液代謝有關(guān)[10]，選擇AQP1,2,3的基因表達(dá)情況了解了薏苡仁的利尿作用的關(guān)系，可見薏苡仁和法薏仁影響了不同的水通道蛋白的基因表達(dá)，這可能與薏苡仁和法薏仁的利尿靶點不同有關(guān)。