吳福平， 朱宏鍇， 陳 瑩， 吳瑜凡， 邵景東

1.張家港檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司，張家港 215600；

2.華東理工大學(xué)分析測(cè)試中心 200237；

3.張家港海關(guān)綜合技術(shù)中心，張家港 215600

空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，C．jejuni）是主要食源性病原菌之一，可引起人及動(dòng)物多種疾病，主要癥狀為腹瀉性腸炎［1-3］。

目前，在空腸彎曲菌檢測(cè)鑒定中，實(shí)驗(yàn)室主要采用傳統(tǒng)生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定方法。傳統(tǒng)生化鑒定方法主要包含革蘭氏染色鏡檢，動(dòng)力觀察，25℃微需氧、42℃有氧生長(zhǎng)試驗(yàn)，馬尿酸鹽、吲哚乙酸酯水解等試驗(yàn)，有條件的實(shí)驗(yàn)室或使用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行鑒定，鑒定周期較長(zhǎng)，操作相對(duì)繁瑣，同時(shí)鑒定結(jié)果也受培養(yǎng)基、試劑質(zhì)量、培養(yǎng)條件、生長(zhǎng)狀態(tài)等外部因素影響。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR、16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)、多重PCR法等技術(shù)也越來(lái)越多的應(yīng)用于空腸彎曲菌的檢測(cè)，有效填充了空腸彎曲菌的快速檢測(cè)鑒定技術(shù)空白［4-6］。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption／ionization time of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）主要以細(xì)菌表面蛋白為檢測(cè)對(duì)象，依據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)蛋白指紋圖譜與待測(cè)樣品的指紋圖譜分析比對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)微生物的快速鑒定。本文對(duì)從雞胴體中分離到的一株病原菌，通過(guò)MALDI-TOF-MS技術(shù)將其快速鑒定。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)菌株：空腸彎曲菌Campylobacter jejuni NCTC11168；Bolton肉湯、mCCDA瓊脂、Skirrow血瓊脂平板、哥倫比亞血瓊脂平板，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、BTS標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自德國(guó)Bruker公司；VITEK2 NH鑒定卡，購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；乙腈，無(wú)水乙醇，甲酸，三氟乙酸（TFA）。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Microflex），德國(guó)Bruker公司生產(chǎn)；全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK2 Compact，法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)；微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備，微需氧培養(yǎng)裝置：提供微需氧條件（5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮?dú)猓?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化

參照GB 4789.9-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)空腸彎曲菌檢驗(yàn)》［7］操作。

1.2.2 彎曲菌屬的鑒定，挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，動(dòng)力觀察，氧化酶試驗(yàn)，25℃微需氧生長(zhǎng)試驗(yàn)，42℃有氧生長(zhǎng)試驗(yàn)。

1.2.3 空腸彎曲菌的鑒定，將符合上述彎曲菌屬反應(yīng)的細(xì)菌進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，馬尿酸鹽水解試驗(yàn)，吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)。同時(shí)使用VITEK2 NH鑒定卡，麥?zhǔn)蠞舛日{(diào)節(jié)至2.70～3.30之間，通過(guò)VITEK2 compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。

1.3 MALDI-TOF MS鑒定

1.3.1 溶液配制

溶劑I：按水∶乙腈∶三氟乙酸為47.5∶50∶2.5（v／v）的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用；BTS標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用50μL溶劑I溶解BTS標(biāo)準(zhǔn)品。用移液器反復(fù)吹吸溶解BTS粉末，室溫放置5 min，再次溶解，待BTS全部溶解后，瞬時(shí)離心，用200μL PCR管進(jìn)行分裝，每管5μL，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

CHCA基質(zhì)溶液的配制：在CHCA粉末中加入溶劑I，使CHCA終濃度為10 mg／mL。振蕩混勻，直至溶液澄清。用1.5 mL離心管進(jìn)行分裝，每管50 μL，用封口膜密封管口，室溫放置備用。

1.3.2 樣品前處理

采用甲酸提取法前處理，在EP管中加入300 μL去離子水，挑取單個(gè)菌落，混勻后加入900μL無(wú)水乙醇，13 000 r／min離心2 min，吸棄上清，必要時(shí)可再次離心，以便去除乙醇；室溫干燥3～4 min，沉淀中加入30μL 70%甲酸溶液，混勻，加入30μL乙腈13 000 r／min離心2 min；吸取1μL上清至靶盤(pán)點(diǎn)樣，待晾干以后，立即覆蓋1μL基質(zhì)溶液，干燥以后上機(jī)。

1.3.3 數(shù)據(jù)采集分析與判定

用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)儀器校準(zhǔn)后，應(yīng)用FlexControl、Bio-Typer軟件對(duì)樣品圖譜信息采集和分析。以待檢樣品與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株譜圖的符合度為判斷標(biāo)準(zhǔn)，分值越高表示鑒定準(zhǔn)確性的可信度越高。分值在2.300～3.000之間，可完全確認(rèn)鑒定結(jié)果；2.000～2.299，可基本確認(rèn)鑒定結(jié)果；1.700～1.999，為不確定結(jié)果；0.000-1.699，表示鑒定結(jié)果不可信。

1.3.4 MALDI-TOF-MS空腸彎曲菌數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充

運(yùn)用MALDI-TOF-MS對(duì)空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11168進(jìn)行圖譜數(shù)據(jù)采集，并將有效譜圖添加至鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌傳統(tǒng)生化鑒定

觀察菌落形態(tài)特征，mCCD平板，淡灰色菌落，有金屬光澤，扁平；Skirrow血瓊脂平板，灰色扁平菌落，濕潤(rùn)有光澤。鏡檢為革蘭氏陰性菌，菌體彎曲如小逗點(diǎn)；動(dòng)力觀察呈現(xiàn)螺旋狀運(yùn)動(dòng)；氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，25℃微需氧、42℃有氧生長(zhǎng)試驗(yàn)均未生長(zhǎng)；過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性；馬尿酸鹽水解試驗(yàn)陽(yáng)性；吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)陽(yáng)性。

2.2 VITEK2 NH鑒定

根據(jù)全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)NH卡生化反應(yīng)結(jié)果，該分離菌株鑒定為空腸彎曲菌。

2.3 MALDI-TOF-MS檢測(cè)

通過(guò)檢測(cè)及軟件分析，以檢測(cè)到的離子峰強(qiáng)度（intens）為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比（m／z）為橫坐標(biāo)，獲得的分離菌蛋白指紋圖譜具體如圖1所示。與Bruker數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，分離菌被鑒定為空腸彎曲菌，匹配分值為2.208，可基本確認(rèn)鑒定結(jié)果。

2.4 MALDI-TOF-MS空腸彎曲菌數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充

本次試驗(yàn)共采集24張空腸彎曲菌NCTC11168有效譜圖（見(jiàn)圖2），并將譜圖添加到細(xì)菌鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)中。

圖2 24張空腸彎曲菌NCTC11168有效譜圖譜疊加結(jié)果

2.5 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充后驗(yàn)證

經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充后，分離菌株鑒定為空腸彎曲菌，匹配分值由2.208提升至2.538，完全確認(rèn)菌株鑒定結(jié)果。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充后，有效提高了MALDITOF-MS在鑒定空腸彎曲菌的可信度。

3 討論

MALDI-TOF-MS作為一種新型快速鑒定技術(shù)，在臨床和疾控系統(tǒng)病原微生物的檢測(cè)得到了廣泛應(yīng)用［8-14］。該技術(shù)針對(duì)細(xì)菌蛋白特征圖譜進(jìn)行鑒定，具備良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，受培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間以及其他培養(yǎng)條件等外部因素的影響較小［15］，可快速鑒別區(qū)分不同微生物。本文通過(guò)MALDI-TOF-MS技術(shù)將雞胴體中分離到的一株病原菌進(jìn)行快速鑒定，結(jié)果顯示，MALDI-TOF-MS法鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)法一致，鑒定為空腸彎曲菌，且可信度較高。

MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)蛋白指紋圖譜完整、準(zhǔn)確性決定了該項(xiàng)鑒定技術(shù)的準(zhǔn)確率，數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株的數(shù)量和種類(lèi)越豐富、蛋白指紋圖譜越完善，所鑒定的結(jié)果越準(zhǔn)確。此文通過(guò)對(duì)NCTC11168空腸彎曲菌24張有效圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充后，野生菌株鑒定的分值由2.208提升至2.538，由可基本確認(rèn)提升為可完全確認(rèn)鑒定結(jié)果。數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充后，有效提高了MALDI-TOF-MS菌株鑒定的可信度。

在檢測(cè)時(shí)間上，從獲得純菌落到出鑒定結(jié)果，MALDI-TOF-MS法整個(gè)過(guò)程大約需要30 min，上機(jī)后僅需約30 s即可實(shí)現(xiàn)對(duì)1株待測(cè)菌的有效鑒定。成本方面僅需少量基質(zhì)，靶塊清洗后可重復(fù)使用，耗材使用成本低，同時(shí)1塊靶塊1次可實(shí)現(xiàn)384株待測(cè)樣品的高通量檢測(cè)。MALDI-TOF-MS技術(shù)在空腸彎曲菌檢測(cè)鑒定方面可部分替代傳統(tǒng)生化鑒定和分子生物學(xué)鑒別方法，可以廣泛應(yīng)用于微生物實(shí)驗(yàn)室的日常檢驗(yàn)中，尤其適用于醫(yī)院的臨床樣本及食物中毒樣本快速診斷鑒定檢測(cè)。

綜上所述，MALDI-TOF-MS作為新型快速檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)空腸彎曲菌具備快速、準(zhǔn)確、高通量、低成本等檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，可用于食品中空腸彎曲菌的快速篩檢，也為其它食源性致病菌快速鑒定方法的建立提供參考。