范智彥 聶愛蕊 侯劍梅 趙立濤

(臨沂市第三人民醫(yī)院 1藥劑科，山東 臨沂 276023；2臨床藥學(xué)室；3臨沂市蘭陵縣中醫(yī)醫(yī)院藥劑科；4山東大學(xué)藥學(xué)院)

胃癌是一種發(fā)病率很高的消化系統(tǒng)腫瘤，中國胃癌的發(fā)病率居全球的第五位，并且死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢〔1〕?，F(xiàn)階段治療胃癌的主要手段有放療、化療、手術(shù)和靶向治療。放化療過程中會(huì)出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)，常常影響患者的治療結(jié)果〔2,3〕。因此尋找低毒有效的輔助抗腫瘤藥物尤為重要。厚樸為木蘭科植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮〔4〕。具有燥濕祛痰、下氣止瀉之功效〔5〕。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，厚樸中的厚樸酚能抑制腫瘤血管生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增長、黏附和遷移〔6〕。奧沙利鉑是一種常用的化療藥物，可以與DNA形成共價(jià)結(jié)合，抑制DNA復(fù)制與合成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用〔7〕。研究表明奧沙利鉑對胃癌〔8〕、肝癌〔9〕、卵巢癌〔10〕有作用。然而，目前有關(guān)厚樸在胃癌方面的研究較少，并且厚樸與奧沙利鉑聯(lián)合對胃癌的藥理作用也鮮有報(bào)道。本文探討厚樸水煎液聯(lián)合奧沙利鉑對胃癌的作用，通過構(gòu)建大鼠胃癌模型，觀察厚樸提取液聯(lián)合奧沙利鉑對胃癌大鼠的瘤體重量、胃癌組織中細(xì)胞凋亡及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物和細(xì)胞 Wistar雄性大鼠50只，SPF級飼養(yǎng)，體重(220±20)g，由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。人BGC823胃癌細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2試劑和主要儀器 奧沙利鉑(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，厚樸(河北安國昌達(dá)中藥飲片有限公司)，白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司)，末端DNA轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，bFGF和NF-κB抗體(圣克魯斯生物技術(shù)有限公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)，高速離心機(jī)(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)，倒置熒光顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)，酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技公司)，超薄切片機(jī)(德國萊卡公司)，電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和厚樸水煎液的制備 人胃癌BGC823細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期，調(diào)整到細(xì)胞密度5×105/ml備用。稱取厚樸500 g進(jìn)行粉碎，加10倍量、8倍量、6倍量的水分別煎煮1 h，紗布濾過，合并濾液，濃縮至生藥量為1 g/ml的厚樸水煎液，4 ℃冷藏備用。

1.4動(dòng)物模型的建立及給藥 將大鼠腹腔注射阿糖胞苷200 mg/kg，以60Co-γ射線全身照射20 min，24 h后于近腹股溝處接種胃癌細(xì)胞懸液1.0 ml，復(fù)制大鼠胃癌模型。Wistar大鼠50只隨機(jī)分為空白組、模型組、厚樸水煎液組、奧沙利鉑組、厚樸水煎液聯(lián)合奧沙利鉑組(聯(lián)合組)各10只?？瞻捉M不做任何處理，其余各組都進(jìn)行造模。造模30 d后，厚樸水煎液組灌胃厚樸水煎液(1 g/kg)，1次/d；奧沙利鉑組腹腔注射奧沙利鉑溶液(20 mg/kg)，2次/w。聯(lián)合組同時(shí)給予厚樸水煎液(1 g/kg)和奧沙利鉑(20 mg/kg)?？瞻捉M和模型組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥8 w。

1.5大鼠腫瘤重量測定及腫瘤病理學(xué)變化 大鼠末次給藥后，取出大鼠瘤體組織，電子天平稱取瘤體重量，測定抑瘤率。抑瘤率=(對照組平均質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均質(zhì)量)/對照組平均質(zhì)量×100%。將瘤體組織用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，包埋成石蠟切片。將切片依次放入二甲苯、HE染色，最后用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理學(xué)變化。

1.6TUNEL檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況 將瘤體組織常規(guī)脫水后，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，再用0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(PBS)作為滲透液。使用TUNEL混合溶液與載玻片混合后，再與過氧孵育化物酶(POD)孵育60 min，然后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液染色，最后用蘇木素進(jìn)行染色，上鏡觀察，陽性細(xì)胞顯示棕黃色。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β水平 大鼠腹主動(dòng)脈取血后，3 500 r/min離心10 min，收集血清。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。測定血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β水平。

1.8免疫組化檢測bFGF和NF-κB蛋白表達(dá) 將腫瘤組織用10%多聚甲醛固定后，加入bFGF和NF-κB抗體進(jìn)行孵育，最后用DAB和蘇木素進(jìn)行復(fù)染，上鏡觀察，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，陽性染色為棕黃色，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)，AI =(陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100 %。

1.9Western印跡檢測腫瘤組織中bFGF和NF-κB蛋白表達(dá) 提取經(jīng)厚樸水煎液和奧沙利鉑處理的腫瘤組織的總蛋白，用BCA試劑盒測定總的蛋白濃度。然后經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉進(jìn)行檢測，用β-actin進(jìn)行蛋白定量分析。

1.10RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測腫瘤組織中bFGF和NF-κB mRNA表達(dá) 收集經(jīng)厚樸水煎液和奧沙利鉑處理的腫瘤組織，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒檢測腫瘤組織中bFGF和NF-κB mRNA表達(dá)，采用2-△△Ct法檢測相應(yīng)mRNA表達(dá)量。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組瘤體重量及抑瘤率 與模型組〔(2.15±0.47)g〕相比，厚樸水煎液組〔(1.68±0.53)g〕、奧沙利鉑組〔(1.41±0.93)g〕和聯(lián)合組的腫瘤組織重量〔(0.87±0.26)g〕明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且聯(lián)合組明顯低于厚樸水煎液組和奧沙利鉑組(P<0.05)；聯(lián)合組抑瘤率(59.53%)明顯高于樸水煎液組(21.80%)和奧沙利鉑組(34.42%；P<0.05)。

2.2HE染色觀察各組腫瘤組織病理變化 模型組腫瘤細(xì)胞排列緊密，生長旺盛，細(xì)胞間質(zhì)完整清晰，細(xì)胞核體積增加，核仁明顯；厚樸水煎液組腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡樣，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)異常；奧沙利鉑組腫瘤細(xì)胞核間隙增寬，壁細(xì)胞異形改變；聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞體積大小不一，核碎裂形成，染色質(zhì)出現(xiàn)明顯異常，壁細(xì)胞大量破裂，腫瘤細(xì)胞凋亡較多。見圖1。

2.3TUNEL染色觀察各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況 模型組腫瘤細(xì)胞生長旺盛，基本未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞；厚樸水煎液組和奧沙利鉑組有部分凋亡細(xì)胞；兩藥聯(lián)合處理后，腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增多，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯高于模型組、厚樸水煎液組和奧沙利鉑組。見圖2。與模型組〔(6.73±2.41)%〕相比，厚樸水煎液組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組的胃癌組織AI〔(14.61±3.29)%、(15.43±4.87)%、(21.43±1.82)%〕明顯升高(P<0.01)。聯(lián)合組AI明顯高于厚樸水煎液組和奧沙利鉑組(P<0.05)。

圖1 各組胃癌組織病理學(xué)變化(HE染色，×400)

腫瘤細(xì)胞核染成藍(lán)色，黑色箭頭代表凋亡細(xì)胞(棕色)圖2 各組胃癌細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.4ELISA檢測血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β水平 與空白組相比，模型組IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，厚樸水煎液組、奧沙利鉑組和聯(lián)合組血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)。聯(lián)合組明顯低于厚樸水煎液組和奧沙利鉑組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組血清中炎癥因子水平比較

2.5免疫組化檢測胃癌組織中bFGF和NF-κB蛋白表達(dá) 陽性細(xì)胞為棕色顆粒。與空白組相比，模型組bFGF和NF-κB蛋白表達(dá)顯著上升，陽性細(xì)胞明顯增多；與模型組相比，厚樸水煎液組和奧沙利鉑組bFGF和NF-κB蛋白表達(dá)水平降低，陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少；與厚樸水煎液組和奧沙利鉑組相比，聯(lián)合組bFGF和NF-κB蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低。見圖3。

黑色箭頭代表陽性細(xì)胞圖3 各組胃癌組織中bFGF和NF-κB蛋白表達(dá)(DAB染色，×200)

2.6Western印跡及RT-PCR檢測胃癌組織中bFGF和NF-κB蛋白及mRNA表達(dá) 與空白組相比，模型組bFGF和NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)顯著提高(P<0.01)；與模型組相比，厚樸水煎液組和奧沙利鉑組和聯(lián)合組bFGF和NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)；與厚樸水煎液組和奧沙利鉑組相比，聯(lián)合組bFGF和NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步顯著降低(P<0.05)。見表2、圖4。

表2 各組胃癌組織中bFGF和NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)

1～5：空白組，模型組，厚樸水煎液組，奧沙利鉑組，聯(lián)合組圖4 Western印跡檢測各組胃癌組織中bFGF和 NF-κB蛋白表達(dá)

3 討 論

厚樸是一種常用的中藥〔11〕。研究表明，厚樸中的厚樸酚不僅能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞阻滯在G1期和G2/M期〔12，13〕。奧沙利鉑是一種第3代化療藥物，臨床上對晚期胃癌有治療作用，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，影響腫瘤細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制是奧沙利鉑與DNA鏈進(jìn)行交聯(lián)，阻止DNA的復(fù)制和合成〔14〕。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶(FU)協(xié)同用藥有明顯的抗胃癌作用〔15〕。

炎癥因子與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)〔16〕。炎癥因子的感染與局部病變的組織有緊密聯(lián)系。炎癥因子可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，抑制炎癥因子過度表達(dá)可延緩腫瘤生長〔17〕。研究結(jié)果表明，促炎因子IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β在癌癥的生存和增殖過程中發(fā)揮重要作用〔18〕。本研究結(jié)果表明，厚樸提取液和奧沙利鉑均能抑制IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β促炎因子的分泌，發(fā)揮機(jī)體的抗腫瘤作用，并且二藥聯(lián)合效果更佳。

NF-κB主要以二聚體存在于細(xì)胞中，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移〔19〕。NF-κB在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用，抑制NF-κB過度激活可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，破壞胃癌細(xì)胞的生長周期〔20〕。bFGF是一種具有廣泛生物活性的血管生長因子。bFGF作為NF-κB下游靶標(biāo)蛋白，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和分化〔21〕。研究表明bFGF在胃癌組織中高度表達(dá)，抑制bFGF蛋白表達(dá)可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞生長〔22〕。本研究結(jié)果表明，厚樸提取液和奧沙利鉑均能顯著抑制大鼠胃癌組織中NF-κB和bFGF蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗胃癌作用，尤其是以二藥聯(lián)合治療組效果最顯著。

綜上，厚樸提取液和奧沙利鉑能顯著誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其抗胃癌作用機(jī)制與調(diào)控NF-κB/bFGF通路，降低NF-κB和bFGF蛋白的表達(dá)有關(guān)。厚樸提取液和奧沙利鉑具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，可進(jìn)一步提高抗腫瘤效果，達(dá)到了臨床治療胃癌的目的。