張湘龍， 凌智輝， 龍智博， 王旭軍， 吳領席， 唐 其， 陸 英

(湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院1，長沙 410128) (林產(chǎn)可食資源安全與加工利用湖南省重點實驗室2，長沙 410128) (懷化市通道侗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局3，懷化 418500)

高脂血癥是由脂質(zhì)沉積或代謝異常而引發(fā)的一類代謝性疾病，是導致動脈粥樣硬化以及冠狀動脈基本的主要危險因素之一[1]，臨床表現(xiàn)為血清中甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高以及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低[2]。目前治療高脂血癥最有效的方法是降低血液中血脂，市場上常用的一些降脂藥物大多都是合成藥物，通常存在一些副作用，近年來，具有預防和治療高脂血癥的天然產(chǎn)物因其副作用小越來越受到人們的青睞[3,4]。

黑老虎[Kadsuracoccinea(Lem.) A. C. Smith]是五味子科南五味子屬(KadsuraKaempf.exJuss.)的常綠木質(zhì)藤本野生植物，別名冷飯團、鉆地風等，主要分布于湖南、廣西等地，其根莖為民間藥物，味辛、微苦、性溫，具有行氣止痛、散瘀活血的功效，常用于治療風濕骨痛、跌打損傷、腸胃病及婦科病等[5]。現(xiàn)代研究表明，黑老虎中主要化學成分是三萜類和木脂素類化合物，其次還有倍半萜類、甾體類等成分[6,7]。黑老虎果實可食用，為聚合果，每顆果粒中一般含2～4顆種籽，占單顆果鮮質(zhì)量的7%～15%。種籽由外種皮、內(nèi)種皮及種仁組成，外種皮為薄層木質(zhì)，易碎剝離，內(nèi)種皮為褐色薄膜狀，緊貼于種仁上，很難剝離。帶有內(nèi)種皮的黑老虎籽味道極苦，完全不能食用，因此除生產(chǎn)種苗外，一般作為廢棄物丟棄。現(xiàn)黑老虎種籽水煮后可將內(nèi)種皮去除，得到去苦味種仁。本研究采用壓榨法制備去苦味和苦味油脂，測定其中主要成分含量，并研究油脂的長期毒性及降脂功能，旨在為黑老虎籽油開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1號油脂(去內(nèi)種皮黑老虎籽榨油)、2號油脂(帶內(nèi)外種皮黑老虎籽榨油)、齊墩果酸(≥98%)、五味子酯甲(≥98%)、變色酸(分析純)、37種脂肪酸甲酯混合標準品(≥99%)、二十一碳酸甲酯(≥98%)；無水甲醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸、濃硫酸、異辛烷等均為分析純；SPF級C57BL/6j小鼠(雄性，體重23～27 g);基礎飼料和高脂飼料(配方為基礎飼料中加入高脂、高糖、1.25%膽固醇和0.5%膽酸);總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度蛋白膽固醇(LDL-C)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)等試劑盒。

1.2 儀器與設備

GC-2010氣相色譜儀，UVmini-1240紫外分光光度計，JB-P5包埋機，RM2016病理切片機，Nikon Eclipse E100正置光學顯微鏡，NIKON DS-U3成像系統(tǒng)，Epoch酶標檢測儀，KZ-Ⅱ高速組織研磨儀。

1.3 方法

1.3.1 三萜含量測定

參考文獻[8]中的方法。

1.3.2 木脂素含量測定

參考文獻[9]中的方法。

1.3.3 脂肪酸含量測定

1.3.3.1 樣品甲酯化處理

按GB 5009.168—2016方法。

1.3.3.2 脂肪酸含量測定

采用氣相色譜儀測定脂肪酸含量，以37種脂肪酸甲酯標準品定性，內(nèi)標法定量，樣品中脂肪酸含量計算按照GB 5009.168—2016方法進行。

氣相色譜條件：DB-WAX型毛細管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)載氣：N2；進樣口溫度：220 ℃，分流比10∶1；檢測器溫度：250 ℃，尾吹流量：25 mL/min；程序升溫條件：初始溫度75 ℃，以10 ℃/min升至165 ℃，保持1.5 min，以1.5 ℃/min升至185 ℃，保持5 min，以1.5 ℃/min升至195 ℃，保持5 min，以3.2 ℃/min升至240 ℃，保持8 min；柱流速：0.9 mL/min；進樣量：1.0 μL。

1.3.4 黑老虎籽油食用油劑量長期毒性實驗

根據(jù)人和動物的體表面積計算法、不同種類動物之間藥物劑量換算法，小鼠灌胃劑量2、4、6 mL/kg換算成人的劑量為0.17、0.33、0.50 mL/kg。

1.3.4.1 灌胃藥液制備

2種油脂分別取10 mL，加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，渦旋混勻，配制體積分數(shù)分別為0.05、0.1、0.15 mL/mL的混懸藥液。

1.2.4.2 長期毒性實驗方法

選用體重在23～27 g區(qū)間，等級為SPF的雄性小鼠80只，隨機分成8只一組的10個小組，分別為1號油脂低、中、高劑量組、2號油脂低、中、高劑量組和空白對照組，實驗前16 h禁止進食，然后每小組每天分別通過口灌胃給予不同體積分數(shù)的混懸藥液0.8 mL，空白對照組給予相等量的純水，連續(xù)28 d，觀察毒性反應和恢復的時間、中毒特征及表現(xiàn)、體重發(fā)生的變化和其死亡情況等，記錄樣品體重發(fā)生的變化以及死亡情況。

1.3.5 黑老虎籽油功能性劑量降脂活性研究

根據(jù)人和動物的體表面積計算法、不同種類動物之間藥物劑量換算法，小鼠的灌胃劑量150、300μL/kg換算成人的劑量為12.5、25 μL/kg。

1.3.5.1 動物分組與設計

42只SPF級小鼠飼喂基礎飼料適應性喂養(yǎng)7 d后，根據(jù)體重隨機分為6組，每組7只，分別為：正常對照組、高脂對照組、1號油脂低、高劑量組和3號油脂低、高劑量組，其中正常組和高脂組分別飼喂基礎飼料和高脂飼料，同時10 mL/kg蒸餾水灌胃，其余各組在飼喂高脂飼料的同時采用灌胃方式給予低劑量(150 μL/kg)和高劑量(300 μL/kg)黑老虎籽油(使用0.5%CMC-Na稀釋成與對照組相同的10 mL/kg劑量進行灌胃)。

1.3.5.2 動物實驗及標本收集

實驗期間小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠7只，自由進食、飲水。每天定時灌胃，連續(xù)4周。末次灌胃后當晚禁飲食12 h，不限飲水，次日晨頸椎脫臼處死小鼠，眼球取血至非抗凝管中，放置1 h后4 000 r/min離心10 min取上層血清于-20 ℃冰箱保存；肝臟稱重后放入-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.5.3 檢測指標

測定小鼠脂體比、肝體比、血清脂質(zhì)和抗氧化指標、動脈硬化指數(shù)、肝臟脂質(zhì)和抗氧化指標及HE染色觀察肝臟病理學變化。

1.3.6 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 黑老虎籽油三萜、木脂素含量測定

兩種黑老虎籽油中三萜、木脂素含量測定見表1，三萜含量在2種油脂中無較大差異，木脂素含量2號油脂高于1號油脂，約為1號油脂的1.6倍。

表1 黑老虎籽油中三萜、木脂素的質(zhì)量分數(shù)(n=3)/%

2.2 脂肪酸含量測定

黑老虎籽油脂肪酸組分的質(zhì)量分數(shù)見表2，由表2可知，1號和2號油脂中含有13種脂肪酸，其中5種為不飽和脂肪酸，分別占總脂肪酸的82.07%、82.41%，占油脂總質(zhì)量的67.83%和51.56%；不飽和脂肪酸中又以亞油酸含量最高，占油脂總質(zhì)量的59.70%、43.57%。

表2 黑老虎籽油脂肪酸組分的質(zhì)量分數(shù)(g/100 g)

表3 黑老虎籽油對SPF小鼠體重及肝重的影響(n=8)

2.3 黑老虎籽油長期毒性實驗

小鼠初次灌胃后的0～4 h，2號油脂中、高劑量組小鼠出現(xiàn)精神萎靡的癥狀，之后表現(xiàn)厭食，高劑量組第3天開始死亡，至第6天全部死亡；中劑量組于第4日開始死亡，至第8日全部死亡。其余各組未見明顯異常。生存小鼠處死后解剖均沒有發(fā)現(xiàn)積液和腫瘤，黑老虎籽油對SPF小鼠體重及肝重的影響見表3，樣品組與空白體體重均無顯著差異，1號油脂不同劑量組肝重與正常組無顯著差異，2號油脂低劑量組肝重約為正常組的2倍，表現(xiàn)為肝臟異常肥大。

2.4 黑老虎籽油降脂活性研究

2.4.1 對高脂血癥小鼠脂體比和肝體比的影響

如圖1所示，與空白對照組相比，高脂對照組脂體比顯著增加(P<0.05)，肝體比極顯著增加(P<0.01)，表明造模成功；2種油脂低劑量組、高劑量組脂體比高脂對照組均顯著下降(P<0.05)；1號油脂低、高劑量組和2號油脂低劑量組肝體比高脂對照組均顯著下降(P<0.05)。

注：1為正常對照組，2為高脂對照組，3為1號油脂低劑量組，4為1號油脂高劑量組，5為2號油脂低劑量組，6為2號油脂高劑量組。與空白對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與高脂對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。下同。圖1 黑老虎籽油對高脂血癥小鼠脂體比和肝體比的影響

2.4.2 對高脂血癥小鼠血清抗氧化指標的影響

由圖2可看出，高脂對照組小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)極顯著低于空白對照組(P<0.01)；與高脂對照組相比，1號油脂兩種劑量SOD和T-AOC均極顯著增加(P<0.01)，2號油脂低劑量組SOD和T-AOC均極顯著增加(P<0.01)，2號油脂高劑量組SOD顯著增加(P<0.05)，T-AOC極顯著增加(P<0.01)。

圖2 黑老虎籽油對高脂血癥小鼠血清抗氧化指標的影響

2.4.3 對高脂血癥小鼠血清脂質(zhì)水平的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，高脂對照組小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)極顯著增加(P<0.01)，高密度脂蛋白(HDL-C)極顯著降低(P<0.01)；與高脂對照組相比，1號油脂低、高劑量組TC、TG和LDL-C均極顯著降低(P<0.01)，HDL-C 顯著或極顯著增加(P<0.05，P<0.01)；2號油脂低劑量組TC顯著降低(P<0.05)，低劑量組和高劑量組TG、LDL-C均極顯著降低(P<0.01)，HDL-C 顯著增加(P<0.05)。

圖3 黑老虎籽油對高脂血癥小鼠血清脂質(zhì)水平影響

2.4.4 對高脂血癥小鼠動脈粥樣硬化指數(shù)(AI)的影響

由圖4可看出，高脂對照組AI值極顯著高于空白對照組(P<0.01)；與高脂對照組相比，1號油脂高劑量組AI值顯著降低(P<0.05)；1號油脂低劑量組和2號油脂低、高劑量組均極顯著降低(P<0.01)。

圖4 黑老虎籽油對高脂血癥小鼠AI值的影響

2.4.5 黑老虎籽油對高脂血癥小鼠肝臟脂質(zhì)水平的影響

由圖5可看出，與空白對照組相比，高脂對照組肝臟組織TC、TG極顯著增加(P<0.01)；與高脂對照組相比，1號油脂低、高劑量組TC水平極顯著降低(P<0.01)，2號油脂低劑量組顯著降低(P<0.05)；2種油脂低、高劑量組TG水平均極顯著降低(P<0.01)。

圖5 黑老虎籽油對高脂血癥小鼠肝臟脂質(zhì)水平的影響

2.4.6 對高脂血癥小鼠肝臟抗氧化指標的影響

由圖6可看出，與空白對照組相比，高脂對照組小鼠肝臟SOD顯著降低(P<0.05)；與高脂對照組相比，1號油脂兩種劑量和2號油脂低劑量組SOD和T-AOC水平均顯著增加(P<0.05)；2號油脂高劑量組SOD顯著增加(P<0.05)，T-AOC極顯著增加(P<0.01)。與空白對照組相比，高脂對照組丙二醛(MDA)含量增高，但無統(tǒng)計學意義；與高脂對照組相比，2種油脂各劑量組均有一定降低(約15.5%～20.0%)，也無統(tǒng)計學意義。與空白對照組相比，高脂對照組谷胱甘肽(GSH)顯著降低(P<0.05)，2種油脂不同劑量組有一定增加，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖6 黑老虎籽油對高脂血癥小鼠肝臟抗氧化指標的影響

2.4.7 黑老虎籽油對小鼠肝臟變化的影響

2.4.7.1 肉眼觀察肝臟一般形態(tài)

各組小鼠解剖后觀察肝臟外觀形態(tài)，空白對照組肝臟色澤鮮艷，呈鮮紅色，無病變現(xiàn)象。高脂對照組肝臟腫大，呈灰白色脂肪性變，是典型的脂肪肝。與高脂對照組相比，1號油脂低、高劑量組和2號油脂低劑量組肝臟顏色呈紅色，大小正常，與對照組比較有所改善；2號油脂高劑量組肝臟腫大，色澤呈灰白色，與模型組比較無明顯改善。

2.4.7.2 HE染色肝臟組織病理學觀察

小鼠肝臟組織HE染色圖如圖7所示，空白對照組小鼠肝細胞大小均勻，排列整齊，形態(tài)正常，無明顯的脂肪變性；與空白對照組相比，高脂對照組肝細胞腫脹，胞質(zhì)稀疏，細胞核偏離中心，肝索排列紊亂，細胞內(nèi)與胞間有較多脂滴空泡，充滿大小不等的脂肪滴；與高脂對照組相比，1號油脂低、高劑量組和2號油脂低劑量組細胞間隙與細胞體積明顯變小，脂肪空泡減少。2號油脂高劑量較高脂對照組癥狀稍有改善，但相較其他3組效果不明顯。說明低、高劑量1號油脂和低劑量2號油脂對小鼠高脂血癥有一定預防作用。

圖7 小鼠肝臟組織HE染色圖(10x)

3 討論

通過化學成分含量檢測發(fā)現(xiàn)1號油脂中木脂素類化合物明顯低于2號油脂，三萜含量相近；1號油脂中脂肪酸、不飽和脂肪酸總量和亞油酸含量明顯高于2號油脂，但不飽和脂肪酸總量占脂肪酸總量的比例相同。由此推測油籽的苦味主要來源種皮中的木脂素類化合物。

以食用油劑量對黑老虎籽油進行長期毒性研究，發(fā)現(xiàn)2號油脂低劑量組小鼠肝臟肥大，中、高劑量組小鼠死亡。五味子木脂素中一些化學成分對哺乳動物細胞具有一定毒性，其中五味子乙素在小劑量使用時起保護治療作用，而大劑量使用反而會增加血液和肝臟的脂質(zhì)水平[10-14]；同時，2號油脂味道極苦，可能使小鼠產(chǎn)生厭食癥狀，導致食欲不振，因此，推測2號油脂低劑量組致小鼠肝臟肥大可能是大劑量木脂素所導致，中、高劑量組小鼠死亡可能也是由于木脂素毒性，再加上厭食原因所致。

以功能性油脂劑量對黑老虎籽油進行降脂功效研究，結果表明1號油脂和低劑量2號油脂均具有顯著的降脂作用，這與黑老虎籽油中亞油酸及不飽和脂肪酸含量較高有關，亞油酸具有降脂、預防動脈粥樣硬化、參與脂肪分解與新陳代謝、增強肌體免疫能力等重要生理功能[15-20]。2號油脂降脂作用弱于1號油脂，可能是因為2號油脂中亞油酸及不飽和脂肪酸總量均低于1號油脂；同時，也是由于2號油脂中木脂素含量高于1號油脂，大劑量使用反而會增加血液和肝臟的脂質(zhì)水平。

4 結論

黑老虎籽去內(nèi)外種皮和不去內(nèi)外種皮榨油可得去苦味油籽和不去苦味油脂，2種油脂中三萜含量相近，木脂素含量差異較大；油脂含13種脂肪酸，其中5種為不飽和脂肪酸，分別占油脂質(zhì)量的67.83%、51.56%；不飽和脂肪酸中亞油酸含量最高，分別高達油脂質(zhì)量的59.70%、43.57%。

以食用油劑量使用時，去苦味油脂各劑量組(2、4、6 mL/kg)均無明顯毒性反應；苦味油脂在低劑量時毒性表現(xiàn)為肝臟異常肥大，中劑量和高劑量可致小鼠死亡。

以功能油劑量使用時，去苦味油脂各劑量組(150、300 μL/kg)和2號油脂低劑量組有明顯的降脂作用，今后作為醫(yī)療、保健食品開發(fā)使用，還要進一步對其他毒性進行三致(致畸、致癌、致突變)實驗等研究，確保其安全性。