王婉茹，劉 瑩，劉紅利,2，賀 丹,2，劉藝平,2 ，孔德政,2

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省優(yōu)質(zhì)花卉蔬菜種苗工程研究中心，河南 鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】荷花（Nelumbo nucifera）屬蓮科蓮屬，是我國傳統(tǒng)十大名花中唯一的水生花卉，具有重要的園林觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值，既可觀賞、藥用又可食用。隨著工農(nóng)業(yè)廢水的無節(jié)制排放，荷花的水生環(huán)境受到污染，Cu、Hg、Cr、Pb、Cd 等各類重金屬含量超標(biāo)，其中Cu 的過量累積在水體污染中占據(jù)了很大比例[1]。荷花在銅脅迫下生長狀況受到影響[2]，導(dǎo)致葉片失綠、植株矮小等[3]，研究荷花抗銅脅迫的分子機制對提高荷花耐銅性有很大意義。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在荷花應(yīng)對銅脅迫中發(fā)揮著重要作用，因此對荷花WRKY 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行克隆和表達(dá)分析研究具有很大意義。【前人研究進(jìn)展】WRKY 轉(zhuǎn)錄因子（TFs）是一個大的基因家族[4]，自甘薯WRKY 基因的首次報告以來[5]，來自廣泛植物物種的大量WRKY基因已被特征化并被證明參與生長、發(fā)育、代謝和對環(huán)境線索的響應(yīng)[6-10]。WRKY 蛋白通常包含1～2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域，這一段保守域序列為WRKYGQK加上一個C2H2 或C2HC 的長約60 個氨基酸的鋅指基序的區(qū)域[11,12]。大量的研究證明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在與植物防御相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控反應(yīng)中有著重要的作用，通過調(diào)節(jié)重金屬（鐵、鎘和鋁）的螯合和轉(zhuǎn)運以及減少二次氧化損傷，應(yīng)對過量的重金屬（鐵、鎘和鋁）脅迫[13]。AtWRKY46 基因突變體顯示出蘋果酸分泌增加，根尖中鋁的積累減少，從而提高了鋁的抗性[14]。AtWRKY13 通過直接激活A(yù)tPDR8表達(dá)并減少鎘積累來賦予鎘耐受性[15]。AtWRKY12 通過谷胱甘肽依賴性植物螯合素合成途徑負(fù)調(diào)控鎘的耐受性[16]?！颈狙芯壳腥朦c】荷花的水生環(huán)境重金屬污染嚴(yán)重，銅是重金屬污染的主要成分，關(guān)于荷花抗銅脅迫的研究較少；WRKY 轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物各類防御調(diào)控，荷花WRKY 基因的克隆及抗銅脅迫的研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于荷花銅脅迫轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，克隆荷花NnWRKY22基因，對克隆出的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及在荷花不同組織的表達(dá)模式和銅脅迫處理下的表達(dá)量變化分析，以期為進(jìn)一步探索荷花NnWRKY22的基因功能和該基因參與抗銅脅迫的機制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試荷花品種艷陽天購自河南荷韻花卉有限公司，栽植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)第三生活區(qū)試驗基地，取完全開放的荷花內(nèi)輪花瓣、幼嫩根、新生嫩葉和莖液氮速凍后存于-80 ℃，用于基因不同組織表達(dá)模式分析。待荷花培養(yǎng)到長勢基本一致時，用課題組黃志遠(yuǎn)[17]篩選出的 400 mg·kg-1CuSO4·5H2O對荷花進(jìn)行0、7、14 d 的銅脅迫處理，3 個重復(fù)。取0、7、14 d 銅處理后的荷花葉片樣品液氮速凍并于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于目的基因抗銅脅迫下的相對表達(dá)量分析。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA 的提取和cDNA 的合成 于-80 ℃超低溫冰箱取荷花艷陽天冷凍葉片液氮研磨，采用改良CTAB 法提取荷花葉片總RNA。用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（RR047A，Takara，大連）合成cDNA。

1.2.2 荷花NnWRKY22 基因的克隆 通過實驗室荷花艷陽天抗銅基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得WRKY22基因序列，根據(jù)序列設(shè)計ORF 段全長引物NnWRKY22-F、NnWRKY22-R（表1）。采用擎科生物的1.1×T3 Super PCR Mix 對荷花艷陽天cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，設(shè)置程序：預(yù)變性98 ℃ 2 min；變性98 ℃ 10 s，退火58 ℃10 s，延伸72 ℃ 6 s，35 個循環(huán)；終延伸72 ℃ 2 min；4 ℃保溫。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行跑膠驗證，驗證正確的條帶用天根試劑盒進(jìn)行膠回收，連接 pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化Top10 大腸桿菌，進(jìn)行菌液驗證，挑取陽性克隆送至上海生工測序比對。

1.2.3 荷花NnWRKY22 基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI CDD（Conserved domain database）數(shù)據(jù)庫對NnWRKY22 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，使用ProtParam 進(jìn)行蛋白質(zhì)特性分析，TMHMM 預(yù)測NnWRKY22 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，Signal IP 預(yù)測信號肽結(jié)構(gòu)，SOPMA 工具預(yù)測NnWRKY22 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，NetPhos 3.1 分析磷酸化位點，MEGAX 軟件（Neighbor-Joining，Bootstrap 1000）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析和進(jìn)化樹構(gòu)造。

1.2.4 荷花NnWRKY22 基因的表達(dá)模式分析 為了研究NnWRKY22 在荷花根、莖、葉、花中的表達(dá)模式，使用 Primer Premier 5 設(shè)計特異引物qRT-NnWRKY 22-F、qRT-NnWRKY22-R（表1）進(jìn)行熒光定量PCR分析，選取18S rRNA（表1）為內(nèi)參，用TB Green?Premix Ex Taq? II（RR820A，Takara，大連）試劑盒對CuSO4·5H2O（400 mg·kg-1）處理0、7 和14 d 荷葉的cDNA 樣本進(jìn)行qRT-PCR 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷花NnWRKY22 基因的克隆

以荷花銅脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測出的WRKY22 基因序列設(shè)計引物，荷花葉片的cDNA 為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到一條的573 bp 大小的清晰條帶（圖1）。結(jié)果表明成功克隆出了荷花NnWRKY22 基因，該基因序列含有一個高度保守的WRKY 結(jié)構(gòu)域，共編碼190 個氨基酸（圖2）。

圖1 NnWRKY22 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification of NnWRKY22 gene

圖2 NnWRKY22 基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acids of NnWRKY22

2.2 荷花NnWRKY22 生物信息學(xué)分析

對荷花NnWRKY22 基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該蛋白分子量、等電點分別為21.33 kDa 和9.03；不穩(wěn)定系數(shù)、親水性平均系數(shù)分別為71.93、0.69，推測為不穩(wěn)定的親水性蛋白。由工具分析可知該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)以及信號肽結(jié)構(gòu)；二級結(jié)構(gòu)主要包括無規(guī)則卷曲和α-螺旋，其中無規(guī)則卷曲占比為70.00%；α-螺旋為17.89%；β-折疊占比3.16%。結(jié)構(gòu)域分析表明，NnWRKY22 蛋白特定匹配在WRKY，屬于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子超家族（圖3）。磷酸化位點預(yù)測該蛋白含有27 個磷酸修飾位點，包括絲氨酸（Serine）和蘇氨酸（Threonine）位點各13 個，酪氨酸（Tyrosine）位點1 個（圖4）。另外該蛋白的酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）和堿性氨基酸殘基（Lys+Arg）數(shù)量分別為17 和21，脂肪族指數(shù)為62.16。

圖3 NnWRKY22 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 3 The analysis of conserved domain for NnWRKY22 protein

圖4 NnWRKY22 磷酸化位點預(yù)測Fig. 4 Predicted phosphorylation site of NnWRKY22

通過Blast 網(wǎng)站對荷花WRKY22 氨基酸序列進(jìn)行在線比對，選取12 個物種的WRKY 氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對和進(jìn)化樹構(gòu)建。進(jìn)化樹結(jié)果表明荷花（Nelumbo nucifera）、洛 磯 山 耬 斗 菜（Aquilegia coerulea）和博落回（Macleaya cordata）在同一分支上，水青樹（Tetracentron sinense）和藍(lán)果樹（Nyssa sinebsis）聚為一支，其余8 個物種聚為一支（圖5）。

圖5 NnWRKY22 與其他植物同源WRKY 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 5 Phylogenetic tree on NnWRKY22 and WRKY proteins of other plants

2.3 荷花NnWRKY22 基因的表達(dá)分析

qRT-PCR 結(jié)果表明，在荷花品種艷陽天根、莖、葉和花中均能檢測到NnWRKY22 基因的表達(dá)，但其表達(dá)量存在明顯差異。NnWRKY22 基因在荷花的根中的相對表達(dá)量最高，在荷花的花中表達(dá)量最低，其中在根、莖和葉的表達(dá)量分別是在花中的16.5倍、3.3 倍和3 倍（圖6）。

圖6 NnWRKY22 在荷花不同組織中的相對表達(dá)量Fig. 6 Relative expressions of NnWRKY22 in lotus tissuesThe same as Fig.7.

分析400 mg·kg-1硫酸銅處理下NnWRKY22 基因表達(dá)量隨時間的變化，結(jié)果表明處理7 d 時荷葉中NnWRKY22 的相對表達(dá)量顯著上升并到達(dá)最高值，相比對照組上升了3.4 倍；處理14 d 時表達(dá)量相比處理7 d 下降了19.5%，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（P＜0.01），在銅脅迫7 d 時NnWRKY22 基因的表達(dá)量到峰值，之后開始下降（圖7）。

圖7 銅脅迫下NnWRKY22 的相對表達(dá)量Fig. 7 Relative expressions of NnWRKY22 under copper stress

3 討論與結(jié)論

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族在植物應(yīng)對逆境方面發(fā)揮著重要作用，它們在調(diào)節(jié)植物生長、植物發(fā)育以及生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵性作用[10,18-19]。水稻OsWRKY22 與核心轉(zhuǎn)錄因子ART1 共同作用于OsFRDL4表達(dá)和檸檬酸鹽分泌的正調(diào)控，從而促進(jìn)水稻耐鋁性[20]；番茄SlWRKY6在抗CdCl2、CuCl2、HgSO4 脅迫中發(fā)揮重要作用[21]；水稻OsWRKY15 通過NO、ABA 等信號途徑參與鎘脅迫[22]；WRKY46 作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，在擬南芥鋁脅迫條件下負(fù)性調(diào)節(jié)ALMT1 的表達(dá)[14]。以上結(jié)果表明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物抗重金屬脅迫方面發(fā)揮著重要作用，廣泛參與了植物抗重金屬脅迫的應(yīng)答機制。

本研究從荷花品種艷陽天中克隆得到NnWRKY22基因，該基因序列ORF 段序列長度為573 bp，編碼的氨基酸數(shù)量為190。通過序列比對和進(jìn)化樹分析得出，荷花（Nelumbo nucifera）與洛磯山耬斗菜（Aquilegia coerulea）和博落回（Macleaya cordata）的親緣關(guān)系較近。荷花NnWRKY22 氨基酸序列含有一個高度保守的WRKY 結(jié)構(gòu)域，表示NnWRKY22屬于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子超家族。蛋白特性分析表明荷花NnWRKY22 屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，這與前人在番茄SlWRKY6和梅花PmWRKY2[23]得出的結(jié)論相同。大量研究表明，WRKY 在植物不同組織的表達(dá)具有特異性，杉木ClWRKY44 基因主要在杉木嫩葉中表達(dá)[24]，菊花CmWRKY13[25]基因在根中表達(dá)量最高，枇杷EJWRKY27[26]在根中高表達(dá)。本研究中NnWRKY22 在荷花中的表達(dá)也具有組織特異性，在根中表達(dá)量最高，花中表達(dá)量最低。推測該基因主要通過荷花根部發(fā)揮NnWRKY22 基因功能，參與荷花抗銅脅迫。通過課題組前期對銅脅迫荷花品種艷陽天的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可知[17]，NnWRKY22 是參與銅脅迫的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可能在抗銅脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)荷花中的NnWRKY22 基因在銅脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，在高濃度銅處理7d 表達(dá)量到達(dá)峰值，說明NnWRKY22 參與了荷花抗銅脅迫的應(yīng)答機制，在荷花抗銅過程中發(fā)揮著重要作用，為荷花抵抗銅脅迫提供了新的候選基因。