李婉雪，姚新轉(zhuǎn)，張寶會，劉 洋

（1.貴州大學(xué)茶學(xué)院,貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室/山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心,貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

0 引言

【研究意義】植物在生命周期中會受到如水澇、干旱、冷害等非生物脅迫，影響其生長發(fā)育。煙草是我國重要經(jīng)濟(jì)作物之一，良好的生態(tài)環(huán)境能讓煙草正常生長發(fā)育，產(chǎn)出品質(zhì)優(yōu)良的煙葉，然而在煙草生長過程中會遭受多種逆境脅迫，影響其產(chǎn)量。在以往研究中發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白（zinc finger protein）屬于III 型轉(zhuǎn)錄因子，它廣泛分布于生物體內(nèi)，是調(diào)控諸多生理生化反應(yīng)的一類核酸蛋白，調(diào)控植物的生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)。因此本研究克隆了茶樹中CsZFP2 基因并對該蛋白的組織特異表達(dá)及干旱脅迫下的基因表達(dá)進(jìn)行分析，為研究CsZFP2 基因?qū)Ω珊淀憫?yīng)及抗旱分子機(jī)理研究提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】類黃酮是植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)，它作為重要的活性物質(zhì)，具有抗氧化、心血管保護(hù)等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品等行業(yè)。在以往研究中發(fā)現(xiàn)，類黃酮3′,5′-羥化酶（flavonoid 3′,5′hydroxylase,F3′5′H）是茶樹類黃酮生物的催化酶之一，以影響花色而出名，但B環(huán)的羥基化程度和部位與類黃酮結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、抗氧化功能有著密切關(guān)系[1]。所以類黃酮在植物的生長發(fā)育和抵御逆脅迫等方面發(fā)揮重要功能[2]。外界環(huán)境條件影響植物的生長和發(fā)育，植物為了適應(yīng)外界的逆境條件，進(jìn)化出了一系列生理及分子響應(yīng)機(jī)制[3-5]，調(diào)節(jié)植物的生理生化、蛋白及基因等各方面。高溫、高鹽、干旱等非生物脅迫會影響煙草的正常生長發(fā)育，干旱脅迫使煙草葉片脫水變枯，嚴(yán)重影響其品質(zhì)成分的積累，降低經(jīng)濟(jì)效益。而脅迫響應(yīng)可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來實現(xiàn)，在干旱脅迫環(huán)境下，提高抗氧化系統(tǒng)活性，清除細(xì)胞內(nèi)過量的自由基和過氧化物，抑制膜脂質(zhì)過氧化和保護(hù)細(xì)胞細(xì)胞膜的完整性。對與F3′5′H 基因啟動子區(qū)域互作的鋅指蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)生物信息學(xué)分析和相關(guān)功能驗證，預(yù)測可能參與了高溫、高鹽、干旱等逆境響應(yīng)，將鋅指蛋白轉(zhuǎn)入煙草后增強(qiáng)煙草的耐旱性，有利于進(jìn)一步闡明鋅指蛋白基因表達(dá)模式，為培育抗逆性強(qiáng)的煙草奠定基礎(chǔ)。鋅指蛋白基因家族是植物最大的基因家族之一[6]，其特征為鋅指域由半胱氨酸和組氨酸結(jié)合鋅離子形成[7]。鋅指蛋白（ZFPs）在生理和生物化學(xué)過程中具有重要的作用，其中就包括非生物脅迫[8]。在逆境脅迫方面已有一些報道，例如，剛毛怪柳（Tamarix hispida）中鋅指蛋白ThZFP1 在擬南芥中過表達(dá)，增加了POD 和SOD 活性、脯氨酸含量，增加了相關(guān)基因如P5CS、SOD 和POD 的表達(dá)，最終增加了對鹽脅迫和滲透脅迫的抗性[6]。水稻中轉(zhuǎn)錄因子ART1通過影響鋁脅迫相關(guān)基因的表達(dá)增加水稻對鋁脅迫的抗性[9]；在干旱脅迫下，ZFP245 的過表達(dá)增強(qiáng)了SOD 和POD 的活性，表明ZFP245 可能通過激活植物體內(nèi)的酶活活性，從而提高水稻的耐旱性[10]?！颈狙芯壳腥朦c】有研究結(jié)果表明鋅指蛋白能夠調(diào)控植物的生長發(fā)育和應(yīng)對非生物脅迫，然而關(guān)于茶樹鋅指蛋白的研究有待深入進(jìn)行?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對CsZPF2 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測其潛在分子功能，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CsZPF2基因轉(zhuǎn)入煙草，進(jìn)行干旱脅迫下的功能驗證，觀察自然干旱后煙草的變化，進(jìn)一步了解茶樹鋅指蛋白在煙草中的抗旱機(jī)理，為后續(xù)培育耐旱煙草新種質(zhì)和進(jìn)一步研究超量表達(dá)CsZPF2 煙草對干旱脅迫耐受機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為煙草（Nicotiana tabacun'Xanthin'）。

1.2 基因克隆與載體構(gòu)建

本實驗室在前期工作中已通過酵母單雜篩選出一個與F3′5′H 基因啟動子區(qū)域互作的鋅指蛋白，首先利用Primer5.0 軟件設(shè)計CsZPF2目的基因引物，以cDNA 的第一鏈為模板，克隆目的基因保守片段，獲得擴(kuò)增的目的基因后，以酶切PCR 產(chǎn)物為模板，質(zhì)粒用SalI、SacI 雙酶切，回收連接，將目的基因正向和反向整合到載體的啟動子和終止子之間，構(gòu)建超量表達(dá)載體（圖1）。

圖1 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)載體Fig. 1 Overexpression vector of ZFP transcription factor

1.3 鋅指蛋白cDNA 編碼產(chǎn)物同源序列比對分析

在 NCBI 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索出不同物種的鋅指蛋白，并與CsZFP2鋅指蛋白序列排列比較（DNAMAN,MegAlign Program,Clustal W method）。利用DNAMAN 軟件進(jìn)行同源序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 煙草遺傳轉(zhuǎn)化及分子鑒定

用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化至煙草葉片，取實驗室培養(yǎng)好的煙草無菌苗,切成方片，置于農(nóng)桿菌溶液中侵染8～10 min，將侵染的葉片取出,用無菌濾紙將農(nóng)桿菌菌液吸干,置于共培培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2 d 后接種在含有Kan 抗生素培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，再置于無菌培養(yǎng)室25 ℃光照培養(yǎng),每2 周繼代1 次,30 d 后觀察茶樹愈傷生長情況。

以實驗室無菌苗作為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法[11]進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。待移栽植株成活后剪取葉片進(jìn)行β-葡糖苷酶（β-glucosidase,GUS）組織化學(xué)染色，利用CsZFP2 序列設(shè)計檢測引物，初步鑒定完畢后再從植株葉片中提取基因組DNA 用于PCR鑒定。

1.5 qRT-PCR

提取自然干旱條件下脅迫處理前、后的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草葉片總RNA，將反轉(zhuǎn)后得到的cDNA 作為模板。根據(jù)CsZFP2基因序列，設(shè)計qRTPCR 擴(kuò)增引物，通過qRT-PCR 分析相關(guān)基因的相對表達(dá)量。引物設(shè)計序列：

F：GGAGCCCTTCAGACATCAATTA；

R：CTGCACAAGAACTGCCAAAC。

內(nèi)參對照為煙草 β -actin 基因，

F：5'-TGGTTAAGGCTGGATTTGCT-3'；

R：5'-TGCATCCTTTGACCCATAC-3'。

qRT-PCR 擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件參考劉洋[12]，每個基因設(shè)置3 個重復(fù)。

1.6 煙草的干旱脅迫處理

選取5～6 葉期（煉苗移栽后15 d）、長勢及大小一致的轉(zhuǎn)基因及野生型植株為材料，進(jìn)行自然干旱處理，分別于處理后的0、7、14、21、28 d 剪取煙草葉片，所有樣品均放入液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱備用。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)各平均值差異性的統(tǒng)計學(xué)分析利用SPSS 22.0 軟件包完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹ZPF 基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)預(yù)測

通過搜索比對，將候選基因提交到ExPASy、NCBI 等在線網(wǎng)站驗證其保守域的結(jié)構(gòu)，最終得到11 個物種的鋅脂蛋白基因，進(jìn)一步分析該基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（表1），結(jié)果顯示：11 個物種的鋅指蛋白基因有5 個可以定位在染色體上，其余6 個物種尚不清楚，他們的內(nèi)含子數(shù)相似，最少11 個，最多14 個，其中大多數(shù)物種有13 個內(nèi)含子數(shù)；蛋白長度最短的物種為獼猴桃（Actinidia chinensis var.Chinensis）1 202 aa，最長為灰山杜鵑（Rhododendron griersonianum）、筍 瓜（Cucurbita maxima）、南瓜（Cucurbita moschata）1 256 aa，理論等電點(pI)介于5.62 獼猴桃（Actinidia chinensis var.Chinensis）～5.97 南瓜（Cucurbita moschata）之間，發(fā)現(xiàn)11 個物種的ZPF 基因Pi＜7，表明這11 個物種鋅指蛋白富含酸性氨基酸。

表1 11 個物種鋅指蛋白基因的特征Table 1 Characteristics of ZFP genes in 11 species

2.2 CsZPF2 編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

預(yù)測CsZPF2 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示CsZPF2編碼蛋白質(zhì)具有51.34% α-螺旋，37.39%無規(guī)則卷曲，7.95% 延伸鏈，3.33% β-轉(zhuǎn)角，說明 螺旋為CsZPF2 編碼蛋白質(zhì)的主要二級結(jié)構(gòu)（圖2）。利用Phyre2 在線軟件構(gòu)建CsZPF2三級結(jié)構(gòu)（圖3），分析預(yù)測結(jié)果表明該蛋白為α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角組成無規(guī)則卷曲的三維空間結(jié)構(gòu)。

圖2 CsZPF2 編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 Predicted secondary structure of CsZPF protein

圖3 茶樹ZPF2 編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 Predicted tertiary structure of CsZPF protein

2.3 蛋白質(zhì)親疏水性分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測

對CsZPF2 編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行親水性分析（圖4）。其中大于零部分多于50%為疏水性蛋白，小于零部分多于50%為親水性蛋白，結(jié)果表明，CsZPF2 編碼蛋白為親水性蛋白。通過Cell-PLoc 2.0軟件預(yù)測CsZPF 編碼蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核。

圖4 CsZPF2 編碼蛋白質(zhì)序列的親疏水性分析Fig. 4 Hydrophilicity and hydrophobicity of CsZPF2 protein sequence

2.4 CsZPF2 基因序列同源比對及進(jìn)化樹分析

將CsZPF2 的cDNA 序列進(jìn)行Blastx 分析，結(jié)果顯示，11 個不同物種植株中鋅指蛋白都有很高的同源性，其中茶樹（Camellia sinensis，XM_028257969.1）鋅指蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)域與灰山杜鵑（Rhododendron griersonianum，KAG5536119.1）的鋅指蛋白相似性為 85%，與獼猴桃（Actinidia chinensis var.Chinensis，PSR84926.1）的鋅指蛋白相似性為82.82%，與甜櫻桃（Prunus avium，XP_021810862.1）的鋅指蛋白相似性為73.60%,與水蜜桃（Prunus persica，ONI09200.1）的鋅指蛋白相似性為73.30%，杏花（Prunus armeniaca，CAB4311713.1）的鋅指蛋白相似性為73.00%，與筍瓜（Cucurbita maxima，XP_023002699.1）的鋅指蛋白相似性為71.20%，與煙草（Nicotiana tabacum，XP_016463943.1）的鋅指蛋白相似性為68.57%。選取同源性比較高的物種氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，在進(jìn)化過程中鋅指蛋白基因與獼猴桃和灰山杜鵑有較高的同源性（圖5、6）。

圖5 茶樹鋅指蛋白與其他物種的蛋白質(zhì)序列同源比對Fig. 5 Homologous analysis on ZPF protein sequences of various species

2.5 干旱處理對轉(zhuǎn)CsZPF2 基因煙草的影響

本研究對 5～6 葉期的煙草進(jìn)行了自然干旱脅迫處理，將長勢一致的野生煙草及轉(zhuǎn)基因煙草移栽至室外，相同條件下自然干旱28 d 后，觀察其表型。在干旱28 d 后，兩組材料底部葉片均明顯發(fā)黃，但野生型煙草底部葉片基本完全失綠，呈枯萎狀態(tài)，而轉(zhuǎn)基因煙草底部葉片呈輕度萎蔫狀態(tài)，大部分仍然呈現(xiàn)綠色。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性優(yōu)于野生型煙草（圖7）。

圖6 茶樹鋅指蛋白與其他物種鋅指蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 6 Phylogenetic relationship between ZFP of C.sinensis and other species

圖7 干旱脅迫對煙草植株生長的影響Fig. 7 Effect of drought stress on growth of tobacco plants

3 討論與結(jié)論

鋅指蛋白普遍存在于植物中，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及非生物應(yīng)答等多種生命過程中有重要作用。在水稻中鑒定出一組A20/AN1 類型鋅指蛋白，包括ZFP157 基因能夠誘導(dǎo)低溫、干旱及鹽脅迫[13]。在煙草中過表達(dá)ZFP177 能夠提高煙草對高溫及低溫的抗性[14]。在擬南芥中過表達(dá)AtSAP5 基因能夠提高擬南芥的抗旱性[15]。植物在干旱的逆境脅迫中，SAP類鋅指蛋白部分成員的抗旱功能在水稻及擬南芥等多個物種中得到了驗證。本實驗室在前期工作中通過酵母單雜篩選出一個與F3′5′H 基因啟動子區(qū)域互作的鋅指蛋白，從茶樹中克隆到一個鋅指蛋白基因，將命名為CsZPF2，該基因CDS 全長為4 269 bp，蛋白編碼長度為1 233 aa，具有保守的A20 與N1 鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。鋅指蛋白基因在獼猴桃和灰山杜鵑中具有相應(yīng)同源基因且同源性較高，預(yù)測CsZPF2 編碼蛋白是親水性且為酸性蛋白，α 螺旋為蛋白主要二級結(jié)構(gòu)，預(yù)測亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。茶樹（Camellia sinensis）鋅指蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)域與灰山杜鵑（Rhododendron griersonianum）的鋅指蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，序列相似性為85%。煙草中過表達(dá)ZFP177基因煙草對干旱脅迫更敏感，表明ZFP177 可能提高煙草對干旱的抗性[16-20]。野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草在經(jīng)過28 d 自然干旱脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比更具耐旱性，驗證了該基因在煙草抗旱的生理過程中發(fā)揮功能。

本研究從茶樹中克隆到一個CsZPF2 基因，其具有保守的 A20 與 N1 鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。CsZPF2 基因在多個物種中具有相應(yīng)同源基因，在栽培煙草三星中CsZPF2 基因的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因煙草呈現(xiàn)出抗旱表型，表明該基因參與煙草抗旱早期應(yīng)答的調(diào)控過程且能夠增強(qiáng)煙草抵抗干旱脅迫能力。目前,對于茶樹鋅指蛋白的研究尚處于基因克隆、結(jié)構(gòu)鑒定與表達(dá)分析等層面上，本研究表明過表達(dá)CsZPF2 基因能夠提高煙草的抗旱能力,并且從生物學(xué)功能方面驗證了CsZPF2 基因在煙草抗旱方面的功能,對利用轉(zhuǎn)錄因子提高作物的抗逆性提供重要的參考價值，為作物逆境脅迫提供了重要候選基因,為培育抗旱煙草新品種提供參考。