樓鵬強(qiáng)，鄧小磊，魏波，湯朔，侯德才

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

股骨頭壞死是骨科常見(jiàn)的難治性疾病[1]。建立有效的動(dòng)物模型，對(duì)于探索股骨頭壞死的發(fā)生機(jī)制和新的治療方法均有重要意義。目前用于股骨壞死造模的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和造模方法較多，其中以液氮冷凍法制備的犬股骨頭壞死模型應(yīng)用最為廣泛[2-5]。但對(duì)于造模過(guò)程中液氮冷凍的最佳時(shí)長(zhǎng)，目前尚未見(jiàn)到相關(guān)研究。因此，本研究選擇文獻(xiàn)報(bào)道的4 min[6]和8 min[7]2種冷凍時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行了對(duì)比研究，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康成年雄性比格犬12只，年齡17～23個(gè)月，體質(zhì)量10.1～12.2 kg。所有犬均購(gòu)自沈陽(yáng)康平實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(遼)2014-0003。所有犬均在面積3 m2的犬舍中單獨(dú)飼養(yǎng)，允許自由活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(21000092019051)。

1.2 主要試劑硫酸阿托品注射液(安徽長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H34021900)，鹽酸塞拉嗪注射液(長(zhǎng)沙拜特生物科技研究所有限公司，獸藥字180121777)，舒泰50(法國(guó)維克，批號(hào)：83887902)，注射用頭孢美唑鈉(山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20103440)，戊巴比妥鈉(德國(guó)默克，批號(hào)：W-20180223)，乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)脫鈣液(北京索萊寶科技有限公司)，HE染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 主要設(shè)備GE-D8000 X線機(jī)，GE Signa 1.5T超導(dǎo)MRI系統(tǒng)，Nikon MODEL YS100生物顯微鏡。自制液氮冷凍裝置，該裝置由包納股骨頭、保護(hù)周?chē)M織的工作套筒和引流液氮的導(dǎo)軌2部分組成；其中工作通道由去除針頭端的5 mL注射器外套制成，導(dǎo)軌由去除針頭端的5 mL注射器外套縱向剖開(kāi)后制成；使用時(shí)將導(dǎo)軌插入工作通道內(nèi)(圖1)；使用前，將液氮冷凍裝置于液氮中進(jìn)行預(yù)冷；以上操作均在無(wú)菌條件下完成。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組及造模將12只動(dòng)物隨機(jī)分為冷凍8 min組和冷凍4 min組，每組6只。按0.1 mL·kg-1肌肉注射硫酸阿托品注射液，以減少麻醉過(guò)程中動(dòng)物呼吸道腺體分泌；15 min后，按0.05 mL·kg-1肌肉注射鹽酸塞拉嗪注射液進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉；15 min后，按 0.05 mL·kg-1肌肉注射舒泰50，術(shù)中按0.025 mL·kg-1給藥維持麻醉。麻醉成功后，消毒，剃除犬左髖部約10 cm×16 cm的毛發(fā)，以碘伏消毒后，鋪無(wú)菌手術(shù)單及洞巾。以大轉(zhuǎn)子為中心在股骨干前緣弧形切開(kāi)，切口近端始于近背中線處，遠(yuǎn)端止于股骨近端1/3～1/2處。分離皮下組織，在股骨干前外側(cè)找到股二頭肌與股筋膜、闊筋膜張肌的結(jié)合部，沿著股二頭肌前緣切開(kāi)，將闊筋膜張肌切斷。分離暴露“股三角區(qū)”(背側(cè)為臀中肌、臀深肌,外側(cè)為股外側(cè)肌,內(nèi)側(cè)為股直肌)[8]，向后拉開(kāi)臀中肌和股二頭肌，向上拉開(kāi)闊筋膜和闊筋膜張肌，部分分離臀中肌和股外側(cè)肌的附著部。鈍性分離關(guān)節(jié)囊上附著的脂肪，暴露關(guān)節(jié)囊。順著股骨頸方向剪開(kāi)關(guān)節(jié)囊，向遠(yuǎn)端分離，暴露股骨頭。向外旋轉(zhuǎn)股骨，用彎剪伸到關(guān)節(jié)囊內(nèi)剪斷圓韌帶，將預(yù)制好的液氮冷凍裝置套在股骨頭上，用紗布包繞冷凍裝置以保護(hù)周?chē)M織。沿導(dǎo)軌緩慢注入液氮，2組分別持續(xù)冷凍4 min和8 min。冷凍結(jié)束后，以生理鹽水復(fù)溫3 min左右，以肉眼觀察到的股骨頭表面顏色從蒼白恢復(fù)至接近冷凍前狀態(tài)作為復(fù)溫結(jié)束的標(biāo)志。閉合關(guān)節(jié)囊，將分離的肌肉恢復(fù)至原位并逐層縫合，關(guān)閉切口，術(shù)區(qū)覆蓋無(wú)菌敷料后送回犬舍。術(shù)后7 d內(nèi)，每天按0.1 mL·kg-1肌肉注射頭孢美唑鈉。造模手術(shù)由2名有豐富髖關(guān)節(jié)手術(shù)經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生完成。

2.2 造模結(jié)果評(píng)價(jià)造模手術(shù)后觀察并記錄動(dòng)物的飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)、切口愈合等一般情況。造模后9周，進(jìn)行X線和MRI檢查，并以MRI影像作為判斷股骨頭壞死的標(biāo)準(zhǔn)，即T1WI上股骨頭出現(xiàn)線樣低信號(hào)區(qū)或T2WI上股骨頭出現(xiàn)“雙線征”[9]。影像學(xué)檢查結(jié)束后，按100 mg·kg-1靜脈注射戊巴比妥鈉處死動(dòng)物，取出造模側(cè)股骨頭，觀察股骨頭表面軟骨及股骨頭塌陷情況。股骨頭標(biāo)本大體觀察結(jié)束后，將股骨頭樣本置于10%多聚甲醛中固定2 d，以14%EDTA脫鈣4周，石蠟包埋后冠狀位切片，厚度3 μm，HE染色后在顯微鏡下觀察。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況至最終處死前，2組均無(wú)動(dòng)物死亡。造模手術(shù)后2 d內(nèi)，所有動(dòng)物均開(kāi)始出現(xiàn)飲食減少、精神萎靡、活動(dòng)減少等表現(xiàn)。冷凍4 min組動(dòng)物的上述表現(xiàn)均在1周內(nèi)改善；冷凍8 min組動(dòng)物的上述表現(xiàn)約在2周后逐步恢復(fù)正常，切口愈合緩慢，而且均出現(xiàn)了跛行現(xiàn)象。冷凍8 min組的1只動(dòng)物在造模手術(shù)后第3天出現(xiàn)術(shù)區(qū)皮膚紅腫，造模手術(shù)后1周時(shí)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)部位皮膚組織壞死及化膿，造模手術(shù)后4周時(shí)愈合。

3.2 影像學(xué)檢查結(jié)果

3.2.1X線檢查結(jié)果 冷凍8 min組動(dòng)物造模側(cè)股骨頭均出現(xiàn)了不同程度的變化，如骨質(zhì)硬化、關(guān)節(jié)間隙變窄，但變化不明顯，且部分動(dòng)物的股骨頭出現(xiàn)了囊性變[圖2(1)]；冷凍4 min組僅2只動(dòng)物的股骨頭出現(xiàn)了輕微的骨質(zhì)硬化[圖2(2)]。

白色箭頭指示處顯示關(guān)節(jié)間隙變窄;藍(lán)色箭頭指示處為骨質(zhì)硬化區(qū)域;黃色箭頭指示區(qū)域?yàn)槟倚宰儭?/p>

3.2.2MRI檢查結(jié)果 冷凍8 min組所有動(dòng)物T2WI上均可見(jiàn)股骨頭骨髓水腫和關(guān)節(jié)腔積液表現(xiàn)[圖3(1)]，T1WI上均可見(jiàn)線樣低信號(hào)[圖3(2)]，均達(dá)到股骨頭壞死標(biāo)準(zhǔn)；冷凍4 min組4只動(dòng)物T2WI上可見(jiàn)股骨頭骨髓水腫和關(guān)節(jié)腔積液表現(xiàn)，其余2只動(dòng)物的T2WI上僅可見(jiàn)關(guān)節(jié)腔積液表現(xiàn)[圖3(3)]，T1WI上均無(wú)明顯改變[圖3(4)]。

藍(lán)色箭頭指示處為骨髓水腫;白色箭頭指示處為關(guān)節(jié)腔積液;黃色箭頭指示處為線樣低信號(hào)區(qū)域。

3.3 大體觀察結(jié)果冷凍8 min組股骨頭扁平、表面較粗糙，部分股骨頭出現(xiàn)軟骨裂紋，部分股骨頭軟骨磨損嚴(yán)重[圖4(1)]；冷凍4 min組股骨頭形態(tài)無(wú)明顯改變，表面較光滑，僅部分動(dòng)物的股骨頭出現(xiàn)了軟骨裂紋或輕微軟骨磨損[圖4(2)]。

黃色箭頭指示處可見(jiàn)股骨頭扁平;白色箭頭指示處為軟骨裂紋;紅色箭頭指示處為軟骨磨損處。

3.4 病理學(xué)檢查結(jié)果冷凍8 min組股骨頭組織骨陷窩內(nèi)大部分骨細(xì)胞核消失，同時(shí)可見(jiàn)骨小梁斷裂[圖5(1)]；冷凍4 min組股骨頭組織大部分骨陷窩內(nèi)可見(jiàn)骨細(xì)胞核，骨小梁完整[圖5(2)]。冷凍8 min組股骨頭組織空骨陷窩率高于冷凍4 min組[(20.21±2.6)%，(13.51±3.1)%，t=4.055，P=0.002]。

綠色箭頭指示處為空骨陷窩;黃色箭頭指示處為斷裂的骨小梁;藍(lán)色箭頭指示處為含有細(xì)胞核的骨陷窩。

4 討 論

目前，進(jìn)行犬股骨頭壞死造模的方法很多。激素法易導(dǎo)致犬出現(xiàn)全身并發(fā)癥，且造模成功率較低[10]，因此較少應(yīng)用。創(chuàng)傷法通過(guò)造成股骨基底部骨折，阻斷股骨頭血供誘導(dǎo)股骨頭壞死，但造模手術(shù)操作困難，可重復(fù)性較差[11]。酒精法通過(guò)從股骨大轉(zhuǎn)子向股骨頭建立通道，并向股骨頭內(nèi)注射乙醇，以誘導(dǎo)股骨頭壞死的發(fā)生，但該方法需破壞股骨頭的結(jié)構(gòu)，同時(shí)操作較為困難[12-13]。液氮冷凍法與人類(lèi)股骨頭壞死的病理生理學(xué)過(guò)程相似，而且具有較好的可重復(fù)性[14]。

股骨頭局部經(jīng)液氮冷凍后，骨細(xì)胞發(fā)生壞死，同時(shí)液氮冷凍也導(dǎo)致股骨頭毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、內(nèi)外源性凝血機(jī)制激活，引起毛細(xì)血管微血栓形成，最終導(dǎo)致股骨頭區(qū)域內(nèi)小血管發(fā)生梗阻[15]。此外，液氮冷凍后，血管通透性增加，進(jìn)而發(fā)生血液黏度增加、血液流速減緩等一系列變化，導(dǎo)致股骨頭內(nèi)靜脈淤滯，骨內(nèi)壓增高，并加重股骨頭內(nèi)缺血。而股骨頭復(fù)溫后，血管再通，也可導(dǎo)致股骨頭發(fā)生缺血性再灌注損傷[16]。

本研究中冷凍8 min組1只動(dòng)物出現(xiàn)了術(shù)區(qū)皮膚壞死，這可能是液氮冷凍時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致周?chē)つw組織凍傷所致。因此在進(jìn)行液氮冷凍的操作時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意保護(hù)好周?chē)M織。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中用注射器制作的液氮冷凍裝置，其工作通道的半徑略大于犬股骨頭的半徑，正好容納犬的股骨頭，可以控制液氮冷凍的范圍，同時(shí)以紗布包繞冷凍裝置，很好地保護(hù)了周?chē)M織。感染是髖關(guān)節(jié)手術(shù)中最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。實(shí)驗(yàn)中使用的冷凍裝置均在無(wú)菌條件下完成，從而有效避免了感染的發(fā)生。

本研究的結(jié)果提示，以液氮冷凍法進(jìn)行犬股骨頭壞死造模時(shí)，液氮冷凍8 min的造模成功率高于液氮冷凍4 min。