歐麗瀅?周琛斐?蔡慧華?劉木彪

【摘要】 目的 探討復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病（RVVC）患者陰道微生物的物種組成及其變化情況。方法 招募6例RVVC患者，納入患者均在發(fā)作間期每日采集1份高位陰道拭子進(jìn)行陰道微生物的物種檢測(cè)，并運(yùn)用主坐標(biāo)分析法（PCoA）、繪制樣品熱圖、α多樣性分析等方法分析RVVC患者陰道微生物的物種組成及其變化情況。結(jié)果 組間PCoA結(jié)果顯示RVVC患者陰道微生物物種在發(fā)作間期的組成相似，但在臨近發(fā)作期、發(fā)作日均出現(xiàn)物種差異增大的現(xiàn)象。樣品熱圖分析提示，在RVVC發(fā)作期和發(fā)作間期階段物種的距離較遠(yuǎn)，并在臨近發(fā)作期的生物間差異性開始集中。RVVC患者陰道微生物物種組成結(jié)果分析顯示，乳酸桿菌占比為64.25%，相對(duì)豐度在0.10%～1.00%的菌屬有小類桿菌屬、腸桿菌科、大芬戈?duì)柕戮?、奇異菌屬、氣球菌屬、葡萄球菌屬、厭氧球菌和乳球菌，相?duì)豐度> 1.00%的菌屬有乳酸桿菌屬、普雷沃菌屬、鏈球菌、加德納菌和脲原體。樣品α多樣性分析結(jié)果提示在RVVC發(fā)作間期的物種豐度基本相似，臨近發(fā)作期物種的豐度提升，在發(fā)作前大部分物種在較低的豐度水平。隨訪患者數(shù)個(gè)月經(jīng)周期中以乳酸桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，偶有波動(dòng)但幅度不大，但在各組發(fā)作前均存在一過(guò)性的普雷沃菌增加，也存在加德納菌的增加，時(shí)而波動(dòng)，其他菌屬（如小桿菌屬、大芬戈?duì)柕戮⑵娈惥鷮?、脲原體等）在月經(jīng)期所占比例較低，偶有波動(dòng)，其余菌屬在月經(jīng)周期維持在較低豐度水平。結(jié)論 RVVC患者陰道微生物以乳酸桿菌為主，陰道菌群相對(duì)穩(wěn)定、波動(dòng)性弱，臨床對(duì)其治療應(yīng)注重陰道微生態(tài)環(huán)境的調(diào)理，或可通過(guò)恢復(fù)陰道菌群比例，達(dá)到治愈RVVC的目的。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病;陰道微生物;物種組成;動(dòng)態(tài)變化

Species composition and dynamic changes of vaginal microbiota in patients with recurrent vulvovaginal candidiasis Ou Liying△， Zhou Chenfei， Cai Huihua， Liu Mubiao. △The Second School of Clinical Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510260， China

Corresponding author， Liu Mubiao， E-mail： liumb1972@126.com

【Abstract】 Objective To investigate the species composition and dynamic changes of vaginal microbiota in patients with recurrent vulvovaginal candidiasis （RVVC）. Methods Six patients with confirmed symptomatic RVVC were enrolled in this study. During the onset of RVVC， 1 high vaginal swab sample was collected from each patient on a daily basis to identify the vaginal microbiota. Principal co-ordinate analysis （PCoA）， thermogram analysis and α diversity analysis were adopted to analyze the species composition and dynamic changes of vaginal microbiota in RVVC patients. Results PCoA analysis between groups showed that the species composition of vaginal microbiota in patients with RVVC was similar at the interval between onset， but the species difference was increased at several days before the onset and on the day of onset. Thermogram analysis suggested that the distance between microbiota was large in the onset stage and at the interval between onset of RVVC， and the intermediate difference of microbiota began to converge at several days before the onset stage. The species composition analysis of vaginal microbiota in patients with RVVC showed that Lactobacillus accounted for 64.25%. Bacterial genera with relative abundance between 0.10% and 1.00% included Dialister， Enterobacteriaceae， Finegoldia magna， Atopobium， Aerococcus， Staphylococcus， Anaerococcus and Lactococcus. The genera with relative abundance of >1.00% consisted of Lactobacillus， Prevotella， Streptococcus， Gardnerella and Ureaplasma. The α diversity index evaluation results indicated that the species abundance at the interval between onset of RVVC was similar， which was increased approaching the onset stage， and most returned to a low level of species abundance before the onset. Lactobacillus was the absolute dominant genus during several menstrual cycles of patients receiving follow-up， with small fluctuations. However， there was a transient increase of Prevotella in each group before the onset， and there was also an increase in Gardnerella， which occasionally fluctuated. The proportion of the other genera such as Dialister， Finegoldia magna， Atopobium and Ureaplasma was relatively low， and with few fluctuations. The remaining genera remained at a low level during the menstrual cycle. Conclusions Lactobacillus is the main vaginal microbiota in patients with RVVC. Vaginal microbiota in RVVC patients are relatively stable， with few fluctuations. In clinical treatment， widespread attention should be diverted to the regulation of vaginal microecological environment and restoring the proportion of vaginal microbiota.

【Key words】 Recurrent vulvovaginal candidiasis; Vaginal microbiota; Species composition; Dynamic change

復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌?。≧VVC）是復(fù)雜性外陰陰道假絲酵母菌病的一種，指患者經(jīng)過(guò)治療后臨床癥狀和體征消失，且真菌學(xué)檢查陰性，但仍有外陰瘙癢、排尿疼痛、陰道分泌物等癥狀，據(jù)報(bào)道約5%成年婦女有RVVC[1-2]。RVVC病因復(fù)雜、頑固不愈，其治療策略成為臨床研究熱點(diǎn)[3]。RVVC的病原體中80%～90%為白色假絲酵母菌，研究發(fā)現(xiàn)RVVC發(fā)作期中假絲酵母菌數(shù)量增加，乳酸桿菌比例明顯降低[4]。但也有學(xué)者認(rèn)為指乳酸桿菌的減少并不會(huì)增加RVVC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，乳酸桿菌并非是假絲酵母菌的有效拮抗生物[5]。另有學(xué)者提出，假絲酵母菌和陰道菌群之間的失衡可能是發(fā)生RVVC的主要因素[6]。現(xiàn)階段有關(guān)于RVVC陰道菌群特征的研究也有一定的爭(zhēng)議[7]。近年基因組學(xué)分析顯示，RVVC患者的陰道菌群與健康女性患者的陰道菌群間并無(wú)明顯差異，且RVVC患者乳酸桿菌豐度并未明顯下降，陰道菌群結(jié)構(gòu)也無(wú)明顯改變[8]。目前的研究結(jié)論并不能顯示患者在RVVC發(fā)作間期陰道微生物物種的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)現(xiàn)階段對(duì)于陰道微生態(tài)系統(tǒng)和RVVC發(fā)作之間是否有關(guān)尚無(wú)定論。為此，本研究著重建立動(dòng)態(tài)隊(duì)列，并對(duì)樣本不斷取材，以期能夠捕捉到RVVC發(fā)作間期及發(fā)作期的陰道微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化，為RVVC患者的靶向治療提供參考。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

采取自愿原則，招募2017年在廣東省人民醫(yī)院婦科就診的6名確診為RVVC的患者為研究對(duì)象，分別記為RV-A～RV-F?；颊吣挲g（37.21±6.14）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①已婚女性，年齡20～49歲;②有RVVC臨床癥狀和體征，如外陰瘙癢、外陰灼痛、性交痛或尿痛、外陰紅斑和水腫等，?？茩z查見外陰紅腫、抓痕及外陰黏膜黏附有白色膜狀物或陰道內(nèi)有較多豆腐渣樣分泌物;③實(shí)驗(yàn)室檢查見假絲酵母菌的芽生孢子或假菌絲，或真菌培養(yǎng)陽(yáng)性;④1年內(nèi)有上述癥狀且經(jīng)真菌學(xué)檢查證實(shí)發(fā)作4次或以上，本次就診治療后返院且陰道分泌物真菌學(xué)復(fù)查結(jié)果陰性且未合并其他陰道炎癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有活動(dòng)性細(xì)菌性陰道炎;②處于妊娠期或哺乳期;既往使用過(guò)免疫抑制類藥物;③月經(jīng)不規(guī)律或絕經(jīng);④入組前1周內(nèi)服用過(guò)抗菌藥物或抗真菌類藥物;⑤有全身系統(tǒng)性疾病。本研究方案經(jīng)廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2017230H），入組患者均已簽署知情同意書。

二、方 法

1. 治療方法

入組患者每次復(fù)發(fā)后均予鹽酸特比萘芬陰道泡騰片治療，50 mg/d，持續(xù)用藥7 d。以留取高位陰道拭子（HVS）的首日作為入組的第1日，以患者RVVC再次發(fā)作日為觀察終點(diǎn)。按每例患者留取陰道拭子的先后順序編號(hào)，共取得235份陰道拭子進(jìn)行測(cè)序，其中RV-A 24份（記為A1～A24）、RV-B 25份（記為B1～B25）、RV-C 75份（記為C1～ C75）、RV-D 29份（記為D1～29）、RV-E 54份（記為E1～E54）、RV-F 28份（記為F1～F28）。

2. RVVC患者陰道微生物的物種檢測(cè)

采用生工生物工程（上海）股份有限公司的細(xì)菌基因組 DNA 快速抽提試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書步驟抽提陰道拭子中的細(xì)菌DNA，應(yīng)用微生物多樣性建庫(kù)測(cè)序流程檢測(cè)微生物種類。通過(guò)使用BIPES流程對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，隨后使用UCHIME對(duì)嵌合體序列進(jìn)行摘除，6例RVVC患者的樣本數(shù)量為235份，測(cè)序共獲得18 273 380對(duì)序列，經(jīng)對(duì)雙端序列質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生16 192 661條高質(zhì)量序列，每份樣本至少產(chǎn)生39 517條高質(zhì)量序列，平均產(chǎn)生68 905 條高質(zhì)量序列。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用R語(yǔ)言基于β多樣性得到的矩陣?yán)L制組間主坐標(biāo)分析法（PCoA）圖。基于4種距離算法[binary jaccard、bray curtis、unweighted Unifrac（限細(xì)菌）、weighted Unifrac（限細(xì)菌）]及R語(yǔ)言繪制樣品熱圖，將數(shù)據(jù)進(jìn)行物種或樣品間豐度相似性聚類，再通過(guò)顏色梯度的變化直觀地看出兩兩樣品間的差異性。顏色梯度由藍(lán)色到紅色的變化表示樣品間距離由近到遠(yuǎn)，即兩兩樣品間的差異由小到大變化。細(xì)菌多樣性和豐度圖分別使用α多樣性和堆積條形圖制作。Shannon指數(shù)用于估算樣品中微生物多樣性，Shannon指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。采用單因素方差分析比較6例RVVC患者Shannon指數(shù)間的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。使用MicrobiomeAnalyst創(chuàng)建微生物組圖。其他數(shù)據(jù)和分析均使用GraphPad Prism。

結(jié) 果

一、PCoA分析

R語(yǔ)言繪制的PCoA基于β多樣性分析得到矩陣，展示樣品間物種多樣性差異，結(jié)果顯示RVVC患者發(fā)作間期的物種組成相似，但在臨近發(fā)作期及發(fā)作日均出現(xiàn)物種差異增大的現(xiàn)象，見圖1。

二、樣品熱圖分析

RVVC發(fā)作期和RVVC發(fā)作間期兩者物種的距離較遠(yuǎn)，代表其生物的差異較大，而在發(fā)作期的前幾日，其生物的中間差異開始靠攏，見圖2。6例RVVC患者中的部分圖例分析見圖3。

三、RVVC患者陰道微生物的物種組成

6例RVVC患者陰道微生物物種組成分析結(jié)果顯示，占比在0.10%～1.00%的菌屬有小類桿菌屬（0.98%）、腸桿菌科（0.97%）、大芬戈?duì)柕戮?.94%）、奇異菌屬（0.91%）、氣球菌屬（0.85%）、葡萄球菌屬（0.81%）、厭氧球菌（0.64%）和乳球菌（0.14%），而占比> 1.00%的菌屬包含乳酸桿菌（64.25%）、普雷沃菌屬（10.64%）、鏈球菌（8.24%）、加德納菌（3.27%）和脲原體（1.84%）。

四、樣品α多樣性分析

RVVC患者發(fā)作間期的物種豐度基本相似，臨近發(fā)作期均存在物種豐度的提升，發(fā)作前大部分又恢復(fù)在較低的物種豐度水平，見圖4。6例Shannon指數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 13.205，P < 0.001），其中RV-D、RV-B組內(nèi)多樣性較低，RV-A次之，RV-C、RV-E、RV-F的α多樣性較高，見圖5。發(fā)作期前（RV-A發(fā)作前5～6 d、RV-B發(fā)作前1～4 d、RV-C發(fā)作前6～7 d、RV-D發(fā)作前5～8 d、RV-E發(fā)作前1～3 d、RV-F發(fā)作前5～6 d）存在物種豐度提升情況，臨近發(fā)作期（發(fā)作前1～2 d）大部分又恢復(fù)在較低的物種豐度水平，見圖6。

五、RVVC患者陰道微生物的物種動(dòng)態(tài)變化

對(duì)RVVC患者個(gè)體進(jìn)行動(dòng)態(tài)菌譜圖分析，在隨訪患者數(shù)個(gè)月經(jīng)周期中以乳酸桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，偶有波動(dòng)但幅度不大，但在各組發(fā)作前均存在一過(guò)性的普雷沃菌屬增加，也存在加德納菌屬的增加，時(shí)而波動(dòng)，其他菌屬（如小桿菌屬、大芬戈?duì)柕戮?、奇異菌屬、脲原體等）在月經(jīng)期所占比例較低，偶有波動(dòng)，其余菌屬在月經(jīng)周期維持在較低豐度水平，見圖7。

討 論

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2015年全球陰道假絲酵母菌?。╒VC）患病人數(shù)高達(dá)1.38億，約4.92億女性曾罹患VVC，近年來(lái)VVC發(fā)病率有上升趨勢(shì)[9]。現(xiàn)階段臨床針對(duì)VVC的治療以局部抗真菌藥物為主，但疾病的反復(fù)性成為患者康復(fù)的難點(diǎn)，積極探求針對(duì)RVVC病因的靶向治療方案是目前臨床急需解決的難題[10]。機(jī)體免疫因素、治療不規(guī)范及耐藥菌株的產(chǎn)生等被視為RVVC的可能病因，假絲酵母菌是RVVC的重要病原體，通常情況下假絲酵母菌以孢子相與陰道菌群處于共生狀態(tài)，共同維持陰道內(nèi)微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡和女性生殖健康[11]。陰道微生態(tài)環(huán)境變化與RVVC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有報(bào)道顯示RVVC發(fā)作期陰道乳酸桿菌明顯減少，在抗真菌治療基礎(chǔ)上及時(shí)補(bǔ)充乳酸桿菌，有利于患者陰道微生態(tài)平衡的恢復(fù)，對(duì)減輕患者臨床癥狀和降低RVVC復(fù)發(fā)率有積極意義[12]。有研究者指出，RVVC患者乳酸桿菌豐度并不高，與健康女性陰道菌群的組成并無(wú)明顯差異，且證實(shí)乳酸桿菌的缺失并不明顯增加RVVC患病風(fēng)險(xiǎn)[13]。但上述研究多為橫斷面研究且樣本采集時(shí)間點(diǎn)存在差異，較難體現(xiàn)出RVVC患者致病病原體的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。

既往研究多數(shù)采用清潔度來(lái)判斷陰道炎癥性疾病，但清潔度判斷指標(biāo)中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)僅可反映炎癥的情況，并不能對(duì)患者的發(fā)病起到一定的預(yù)測(cè)作用，因此其在臨床中的應(yīng)用效果并不理想[14]。普遍認(rèn)為陰道微生物與人體微環(huán)境保持動(dòng)態(tài)平衡，評(píng)估RVVC患者陰道微生物的物種組成及其動(dòng)態(tài)變化對(duì)指導(dǎo)其治療有重要的臨床指導(dǎo)意義[15]。有報(bào)道指出，RVVC患者陰道菌群的多樣性有所降低，但多數(shù)RVVC患者的陰道優(yōu)勢(shì)菌屬是乳酸桿菌[16]。本研究中通過(guò)對(duì)RVVC患者進(jìn)行連續(xù)隨訪，并采集患者陰道分泌物觀察RVVC發(fā)作前和發(fā)作過(guò)程中陰道菌群波動(dòng)，以明確RVVC的最佳治療時(shí)間，結(jié)果顯示本組RVVC

患者陰道環(huán)境的優(yōu)勢(shì)菌群與既往報(bào)道的基本吻合，女性陰道中微環(huán)境中乳酸桿菌屬占比最高（64.25%），占比在0.10%～1.00%間菌屬有小類桿菌屬、大芬戈?duì)柕戮?、奇異菌屬等，而占比超過(guò)1.00%的菌屬有乳酸桿菌屬、普雷沃菌屬、鏈球菌等，這些微生物在正常情況下可相互影響并保持一定比例，維持陰道微生態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡[17]。此外本研究還顯示，在隨訪患者數(shù)個(gè)月經(jīng)周期中，以乳酸桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，偶有波動(dòng)但幅度不大，在各組發(fā)作前均存在一過(guò)性的普雷沃菌屬增加，也存在加德納菌屬的增加，時(shí)而波動(dòng)，其他菌屬（如小桿菌屬、大芬戈?duì)柕戮⑵娈惥鷮?、脲原體等）在月經(jīng)期所占比例較低，偶有波動(dòng)，其余菌屬在月經(jīng)周期維持在較低水平。由此推測(cè)普雷沃菌屬和加德納菌的繁殖或許可為假絲酵母菌提供一定的生存空間，但具體作用需要代謝組學(xué)的相關(guān)支持，在日后將進(jìn)一步研究驗(yàn)證。另外，在月經(jīng)周期和藥物治療情況下，RVVC患者陰道菌群波動(dòng)甚微，提示RVVC患者陰道菌群對(duì)內(nèi)外因素的干擾反應(yīng)較小，菌群波動(dòng)性較弱，提示陰道微生物系統(tǒng)失衡可能存在于整個(gè)RVVC發(fā)生發(fā)展階段，由此初步說(shuō)明一旦VVC進(jìn)展成為RVVC，患者治愈的難度將明顯增加，對(duì)于VVC患者的抗微生物藥物治療需規(guī)范且足量才能防止疾病的復(fù)發(fā)。

綜上所述，RVVC患者的陰道菌群相對(duì)穩(wěn)定，波動(dòng)性減弱，且多數(shù)患者陰道微生物以乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌屬，治療中需重視陰道微生態(tài)環(huán)境的調(diào)理。但本研究仍存在局限性，如研究患者例數(shù)少，加之考慮到失訪率及隨訪依從性問(wèn)題，本次隨訪時(shí)間并不長(zhǎng)，數(shù)據(jù)的同質(zhì)性和異質(zhì)性尚存疑。后續(xù)將針對(duì)性地對(duì)RVVC患者陰道菌群開展代謝組學(xué)研究，進(jìn)一步探尋差異基因以明確具體的發(fā)病機(jī)制，為RVVC的靶向治療提供參考。

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（收稿日期：2022-02-28）

（本文編輯：林燕薇）