陳森鎮(zhèn)?陳諾琦?陳錦鳳

【摘要】 目的 測定沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）、信號轉導與轉錄激活因子3（Stat3） 、纖維連接蛋白1（FN1）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）和良性甲狀腺病變中的表達，分析其對PTC的診斷價值，為PTC診斷和鑒別診斷提供依據(jù)。方法 收集甲狀腺疾病病理標本142例，其中PTC組83例，甲狀腺腺瘤組28例，結節(jié)性甲狀腺腫組21例，正常甲狀腺組織組10例。采用免疫組織化學SP法和qPCR方法檢測Sirt1、Stat3、FN1和E-cadherin在4種不同病理類型甲狀腺組織中的表達。結果 Sirt1、Stat3和FN1蛋白與mRNA 在PTC組中的表達明顯高于甲狀腺腺瘤組、結節(jié)性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組織組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均< 0.05）。E-cadherin蛋白和mRNA在PTC組中的表達明顯低于甲狀腺腺瘤組、結節(jié)性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組織組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均< 0.05）。Sirt1和Stat3在PTC組中的表達與淋巴結轉移密切相關，淋巴結轉移組的表達明顯增加，高于無淋巴結轉移組（P均< 0.05），不同性別、年齡患者間Sirt1和Stat3的表達差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05）。FN1和E-cadherin在PTC組中的表達與患者的性別、年齡和有無淋巴結轉移均無關（P均> 0.05）。單一免疫標志物用于診斷PTC時，Sirt1的特異度、靈敏度和診斷準確率均最高。不同組合免疫標志物用于診斷PTC時，Sirt1+Stat3+FN1組合和Sirt1+Stat3+FN1+E-cadherin組合的特異度并列第一（均為98.3%），以Sirt1+Stat3+FN1組合的診斷準確率最高，以Sirt1+FN1的靈敏度最高。結論 Sirt1和Stat3在PTC的發(fā)生發(fā)展以及轉移過程中發(fā)揮重要的作用。

【關鍵詞】 甲狀腺乳頭狀癌;沉默信息調(diào)節(jié)因子1;信號轉導與轉錄激活因子3;纖維連接蛋白1;E-鈣黏蛋白

Expression levels and clinical diagnostic significance of Sirt1 and Stat3 in thyroid carcinoma Chen Senzhen， Chen Nuoqi， Chen Jinfeng. Department of Endocrinology and Metabolism II， Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Zhangzhou 363600， China

Corresponding author，Chen Jinfeng， E-mail： 498972923@qq.com

【Abstract】 Objective To determine the expression levels of silent information regulator 1 （Sirt1）， signal transducer and activator of transcription 3 （Stat3）， Fibronectin （FN1） and E-cadherin in papillary thyroid carcinoma（PTC）and benign thyroid lesions. To analyze their diagnostic values for PTC， providing evidence for the diagnosis and differential diagnosis of PTC. Methods A total of 142 thyroid pathological specimens were collected including 83 cases of PTC （PTC group）， 28 cases of thyroid adenoma （thyroid adenoma group）， 21 cases of nodular goiter （nodular goiter group）， and 10 cases of normal thyroid tissues （normal thyroid tissues group）. The expression levels of Sirt1， Stat3， FN1 and E-cadherin in 4 different pathological types of thyroid tissues were measured by immunohistochemical SP and qPCR. Results The expression levels of Sirt1， Stat3 and FN1 proteins and mRNA in PTC group were significantly higher than those in thyroid adenoma group， nodular goiter group and normal thyroid tissues group（all P < 0.05）. However， the expression level of E-cadherin in PTC group was significantly lower compared with those in thyroid adenoma group， nodular goiter group and normal thyroid tissues group（all P < 0.05）. The expression levels of Sirt1 and Stat3 in PTC group were intimately correlated with lymph node metastasis. The expression levels in lymph node metastasis group were significantly higher than those in no lymph node metastasis group （both P < 0.05）. No statistical significance was observed in terms of age and gender （both P > 0.05）. The expression levels of FN1 and E-cadherin in PTC group were not significantly correlated with gender， age or lymph node metastasis （all P > 0.05）. When a single immunological marker was used to diagnose PTC， the specificity， sensitivity and diagnostic accuracy of Sirt1 were the highest among all markers. Regarding different combinations of immunological markers for diagnosis of PTC， the specificity of Sirt1+Stat3+FN1 and Sirt1+Stat3+FN1+E-cadherin combination were tied first （both 98.3%）， the diagnostic accuracy of Sirt1+Stat3+FN1 combination was the highest， and the sensitivity of Sirt1+FN1 combination was the highest. Conclusion Sirt1 and Stat3 play important roles in the incidence， progression and metastasis of PTC.

【Key? words】 Papillary thyroid carcinoma; Sirt1; Stat3; FN1; E-cadherin

甲狀腺癌是一種常見的內(nèi)分泌腺的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速增加，自1973年以來，甲狀腺癌的年發(fā)病率上升了近50%。越來越多的研究已經(jīng)評估了免疫組織化學標志物在甲狀腺癌中的診斷價值。雖然依靠一些免疫標志物有望區(qū)分甲狀腺良惡性病變，但缺乏可靠的鑒別診斷[1]。因此需要尋找新的免疫化學標志物或組合用于甲狀腺良惡性病變的診斷。本研究采用免疫組織化學SP法和qPCR方法聯(lián)合測定沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）、信號轉導與轉錄激活因子3（Stat3） 在甲狀腺癌中的表達，并分析其在甲狀腺癌中的診斷價值。本研究同時測定纖維連接蛋白1（FN1）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，以期為該類疾病的臨床診治提供一定參考依據(jù)。

對象和方法

一、研究對象

2017年1月至2018年10月于福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院就診的甲狀腺相關疾病的標本142例，其中甲狀腺乳頭狀癌（PTC）83例（PTC組），甲狀腺腺瘤28例（甲狀腺腺瘤組），結節(jié)性甲狀腺腫21例（結節(jié)性甲狀腺腫組），正常甲狀腺組織10例（正常甲狀腺組織組）。PTC組中男28例、女55例;年齡小于45歲36例，45歲以上47例;按有無淋巴結轉移分為有淋巴結轉移組（31例）和無淋巴結轉移組（52例）。上述病例均由本院病理科2位副主任醫(yī)師以上職稱的專家診斷。入選標準：①術前均未進行放射治療、化學治療和內(nèi)分泌治療;②滿足WHO關于PTC的診斷標準則排除在外，如出血、感染、壞死嚴重者。通過手術切除獲取的、用于研究的甲狀腺組織符合醫(yī)院倫理委員會要求（批件號：2021LMB249）。

二、主要試劑及儀器

兔抗人Sirt1單克隆抗體、兔抗人Stat3單克隆抗體、兔抗人FN1單克隆抗體、兔抗人E-cadherin單克隆抗體購自abcam公司;SP免疫組織化學試劑盒、DAB染色試劑盒均購自北京中山金橋生物技術有限公司;RNA提取試劑盒購自北京Qiagen公司;逆轉錄試劑盒購自常州百代生物科技有限公司;熒光定量PCR試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

光學顯微鏡、攤片機、切片機、組織包埋機購自德國Leica;生物安全柜購自上海蘇凈實業(yè)有限公司;低溫離心機購自德國Eppendorf Centrifuge;掌心離心機購自美國AndyBio;PCR熒光定量儀購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

三、實驗方法

采用免疫組織化學SP法、qPCR法分別檢測Sirt1、Stat3、FN1和E-cadherin蛋白及mRNA在PTC、甲狀腺腺瘤、結節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中的表達，具體操作步驟按照試劑說明書進行。免疫組織化學法結果判定：判定結果采用雙盲法，由本院病理科兩位副主任職稱以上的醫(yī)師獨立讀片。染色結果判讀標準采用半定量分析法，以0～4分來判定陽性細胞的百分比，陽性細胞百分比≤5%，0分;陽性細胞百分比6%～25%，1分;陽性細胞百分比26%～50%，2分;陽性細胞百分比50%～75%，3分;陽性細胞百分比> 75%，4分。染色強度無色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。2個指標的乘積作為最終評分：0～1分，陰性;2～4分，弱陽性;5～8分，中陽性;> 9分，強陽性。中陽性和強陽性記為（+），陰性和弱陽性記為（-）。

四、統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件包處理，定性資料比較采用皮爾遜χ2檢驗，當T < 5時，采用連續(xù)性修正χ2檢驗。對正態(tài)分布連續(xù)變量以? 表示，比較采用Student t檢驗，對非參數(shù)分布連續(xù)變量進行Mann–Whitney U檢驗，檢驗水準為α = 0.05，P < 0.05為統(tǒng)計學差異有意義，并計算靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和診斷準確率。

結 果

一、鏡下所見

Sirt1陽性細胞在細胞核中表達，大多呈中～強度陽性。Stat3陽性細胞主要表達于細胞膜和細胞質中，多數(shù)呈中～強度陽性。FN1陽性細胞主要集中在細胞間隙和細胞膜上，大部分呈中～強度陽性。而E-cadherin陽性細胞主要定位在細胞膜上，大多數(shù)呈陰性或弱陽性，見圖1～4。

二、不同病理類型甲狀腺組織中Sirt1、Stat3、FN1、E-cadherin的表達

在PTC組中，Sirt1、Stat3、FN1蛋白的陽性率及mRNA的表達量明顯高于甲狀腺腺瘤組、結節(jié)性甲狀腺腫組及正常甲狀腺組織組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均< 0.05）。而在甲狀腺腺瘤組和結節(jié)性甲狀腺腫組中表達與正常甲狀腺組織組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見圖5、6。相反，E-cadherin蛋白的陽性率及mRNA的表達量在PTC組中明顯低于甲狀腺腺瘤組、結節(jié)性甲狀腺腫組及正常甲狀腺組織組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均< 0.05），在甲狀腺腺瘤組和結節(jié)性甲狀腺腫組中表達與正常甲狀腺組織組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見圖5、6。

三、Sirt1、Stat3、FN1和E-cadherin在PTC組中的表達與臨床病理參數(shù)的關系

免疫組化SP法及qPCR法結果均表明，在PTC組中，Sirt1和Stat3在淋巴結轉移組的表達明顯高于無淋巴結轉移組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均< 0.05）。而不同性別、年齡患者間Sirt1和Stat3的表達差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見表1～2。

同時，在PTC組中，F(xiàn)N1和E-cadherin的表達與患者的性別、年齡以及有無淋巴結轉移均無關（P均> 0.05），見表1、表3。

四、單獨或聯(lián)合檢測Sirt1、Stat3、FN1和E-cadherin對PTC的診斷價值

當單一的免疫標志物用于診斷PTC時，Sirt1的特異度最高，其次是FN1、Stat3、E-cadherin。在靈敏度和診斷準確率方面，Sirt1同樣最高，見表4。采用串聯(lián)方法統(tǒng)計不同組合類型的免疫標志物在診斷PTC的價值時發(fā)現(xiàn)，Sirt1+Stat3+FN1和Sirt1+Stat3+FN1+E-cadherin組合的特異度并列第一，均為98.3%，以Sirt1+Stat3+FN1組合的診斷準確率最高，以Sirt1+FN1組合的靈敏度最高。同時發(fā)現(xiàn)，當聯(lián)合檢測兩種或者多種免疫標志物時，其特異度、靈敏度以及診斷的準確率可能有所提高，進一步提高的PTC的診斷率，見表5。

討 論

隨著敏感成像研究和細針穿刺活檢的廣泛應用，越來越多的甲狀腺癌可早期被發(fā)現(xiàn)，這也間接導致甲狀腺癌發(fā)病率的增加，特別是小于2 cm的甲狀腺癌發(fā)病率的增加。盡管其可以通過手術切除治愈，但死亡人數(shù)也有所增加。目前，甲狀腺癌主要通過手術和放射性碘消融治療，但僅對未轉移的原發(fā)腫瘤有效。轉移性和復發(fā)性腫瘤大多是無法治愈的[2]。因此，早期發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌，并早期進行診斷治療尤為重要。

Sirt1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；?，在大多數(shù)哺乳動物器官中廣泛表達。Sirt1主要通過使多種轉錄因子去乙?；?，如HSF1、NF-κB、PGC-1α、FOXO家族等，參與氧化應激、細胞凋亡等病理生理過程，目前已被廣泛研究。在哺乳動物中，有確鑿的證據(jù)表明Sirt1可以防止由高脂肪飲食引起的代謝損傷以及一些與衰老有關的疾病。由于這些有益的影響，Sirt1激活劑已經(jīng)在應用治療糖尿病的臨床試驗中，并可能在未來應用于其他與年齡相關的疾病。早期的體外研究報道揭示了Sirt1對腫瘤抑制蛋白p53的去乙?；鸵种谱饔?，再加上Sirt1在多種腫瘤類型中的表達增加，提示Sirt1具有致癌作用。然而，與預期相反的是也有文獻報道支持Sirt1作為一種抑癌基因，能抑制腫瘤細胞生長、侵襲，并促進其凋亡。為了明確Sirt1在PTC中的作用，本研究通過免疫組化SP法和qPCR方法，測定了其在PTC中的表達。實驗發(fā)現(xiàn)， Sirt1蛋白和mRNA在PTC患者中的表達明顯高于其在正常甲狀腺組織患者中的表達，且高于甲狀腺腺瘤和結節(jié)性甲狀腺腫患者中的表達，差異均有統(tǒng)計學意義;而Sirt1蛋白和mRNA在甲狀腺腺瘤和甲狀腺腺瘤中的表達與正常甲狀腺組織相比無明顯差異。流行病學資料表明，PTC可發(fā)生于任何年齡，但好發(fā)于年輕女性。本研究結合臨床病理參數(shù)統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，Sirt1的表達與PTC患者的年齡、性別無明顯相關，但淋巴結轉移組表達高于無淋巴結轉移組，與吳文藝等[3]和董玲玲等[4]研究報道基本一致。

Stat3既是一種細胞質信號分子，也是一種核轉錄因子，屬于Stats基因轉錄因子家族。Stat3的激活依賴于特異酪氨酸殘基的磷酸化，激活的Stat3轉移到細胞核內(nèi)，并與靶基因序列一致的啟動子結合，從而激活轉錄過程。越來越多的研究報道了Stat蛋白，特別是Stat3蛋白在腫瘤細胞株以及人體腫瘤標本中持續(xù)異常激活，如胰腺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤以及其他癌癥。本研究結果顯示，PTC組中Stat3蛋白和mRNA的表達明顯高于正常甲狀腺組織組，并高于甲狀腺腺瘤組和結節(jié)性甲狀腺腫組中的表達;而甲狀腺腺瘤和結節(jié)性甲狀腺腫Stat3蛋白和mRNA的表達與正常甲狀腺組織相比無明顯差異。同時還觀察到Stat3的表達與PTC患者淋巴結轉移密切相關，而與患者的年齡、性別無關。此結果表明了Stat3在甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉移中起著重要的作用。

汪永旭等（2013年）報道，Stat3的表達與PTC的年齡呈正相關，Stat3蛋白的陽性率在大于45歲組明顯高于小于45歲組。同樣，Stat3的表達與PTC淋巴結轉移的關系也存在爭議。張晨蕾等（2016年）研究報道PTC中Stat3蛋白的陽性率與淋巴結轉移無明顯相關。但汪永旭等（2013年）認為PTC中Stat3蛋白的陽性率與淋巴結轉移明顯相關，淋巴結轉移組Stat3蛋白的陽性率明顯高于無淋巴結轉移組，表明Stat3的表達與PTC的臨床病理參數(shù)關系密切，在腫瘤的診斷和預后中扮演著重要的角色。此外，本研究免疫組化中Stat3蛋白的陽性率為78.31%，低于張晨蕾等[5]的報道，可能與本研究陽性判斷標準較為嚴格以及標本數(shù)量相對較多有關。

在生長發(fā)育過程中，上皮細胞的特征發(fā)生了巨大的變化，并增加了其運動能力，以便遷移、分支或形成管狀。這種細胞極性和分化狀態(tài)的功能和表型變化過程稱為上皮間質轉化（EMT）[6]。目前，越來越多的研究肯定了EMT的激活在腫瘤發(fā)展轉移中的作用，主要基于主要的間充質標志物，如波形蛋白、FN1、N-鈣黏素和成纖維細胞特異性蛋白-1可以在腫瘤細胞中檢測到[7]。FN1和E-cadherin是兩種主要的間充質標志物，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。本研究結果顯示，一方面正常甲狀腺組織中FN1的表達較低，PTC中FN1的表達異常升高，明顯高于甲狀腺腺瘤和結節(jié)性甲狀腺腫中FN1的表達，而FN1在甲狀腺腺瘤和結節(jié)性甲狀腺腫中的表達與正常甲狀腺組織無明顯差異。另一方面，E-cadherin在PTC中的表達與FN1正好相反，其在PTC中的表達明顯低于甲狀腺腺瘤、結節(jié)性甲狀腺腫和正常甲狀腺組織中E-cadherin的表達，而在甲狀腺腺瘤和結節(jié)性甲狀腺腫中的表達與正常甲狀腺組織無明顯差異，與Sponziello等[8]報道一致。在進一步觀察FN1和E-cadherin的表達與PTC患者臨床病理參數(shù)的關系發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N1和E-cadherin的表達與患者年齡、性別及淋巴結轉移均無關。

Ryu等（1999年）發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌中，淋巴結轉移組中FN1的表達要少于無淋巴結轉移組，主要表現(xiàn)為FN1在細胞外基質的缺失。Wei等（2005年）報道了在甲狀腺癌中，小干擾RNA介導的PTEN的下調(diào)導致FN1的表達下降，從而導致細胞的黏附性降低，間接說明了甲狀腺癌中高表達的FN1可以增強腫瘤細胞之間的黏附，從而減少腫瘤的轉移。而蔣煒杰等[9]認為FN1的表達與甲狀腺癌患者有無淋巴結轉移呈正相關。而本研究結果顯示在PTC中，F(xiàn)N1的表達與有無淋巴結轉移無明顯相關。張宏偉等（2016年）探究了甲狀腺癌中E-cadherin的表達與淋巴結轉移的關系，發(fā)現(xiàn)了在無淋巴結轉移組，E-cadherin表達明顯增加，孫琳（2014年）的研究也肯定了這結果。然而，胥博聞[10]研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌中E-cadherin的表達與淋巴結轉移無明顯相關，與本研究結果一致。因此，F(xiàn)N1和E-cadherin的表達可能在一定程度上參與了甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的過程，可以作為PTC鑒別診斷的一個參考指標。

同時，在評價免疫標志物的診斷價值時發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測兩種或多種免疫標志物時，其特異度、靈敏度以及診斷準確率均明顯提高。由此可見，聯(lián)合檢測Sirt1、Stat3、FN1和E-cadherin在PTC中的表達對其診斷和鑒別診斷的判斷有一定的參考意義。同時，通過研究上述4種基因與PTC的臨床生物學行為的關系，也可提高其術前診斷率，進而進一步優(yōu)化治療方案。

由于各種原因的限制，甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺髓樣癌以及甲狀腺未分化癌的標本較難收集，本研究僅收集了PTC標本作為研究對象，并且本研究未能深入研究Sirt1 / Stat3通路在PTC中的作用，以后將進一步擴大標本類型，進行更深入的探討研究。

參? 考? 文? 獻

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[2] Sosonkina N， Starenki D， Park J I. The role of Stat3 in thyroid cancer. Cancers， 2014， 6（1）：526-544.

[3] 吳文藝， 張麗婷， 傅德強， 等. 沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關酶1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及其意義. 中華實驗外科雜志， 2015， 32（4）：877-880.

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同源蛋白1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及其臨床意義. 臨床外科雜志， 2017， 25（3）：204-207.

[5] 張晨蕾， 李燕萍， 吳靖芳， 等. Stat3，pStat3與TFF3在甲狀腺乳頭狀癌中的臨床意義. 現(xiàn)代預防醫(yī)學， 2016， 43（1）：182-186.

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（收稿日期：2022-01-25）

（本文編輯：楊江瑜）