魏若瑾, 常靜, 楊璐, 潘一帆, 劉科陽, 劉文濤, 王會(huì)利,* , 王瀛寰,朱莉飛

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085

2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049

3. 北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所,北京 100086

作為傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)大國(guó),我國(guó)的農(nóng)藥使用量是世界平均水平的2.5 倍~3 倍[1]。 每年全球農(nóng)藥使用量約30 億kg[2],作為陸地環(huán)境的主要污染物[3],大量殘留農(nóng)藥進(jìn)入土壤或者揮發(fā)到大氣,進(jìn)入土壤中的農(nóng)藥再經(jīng)滲透作用進(jìn)入水體,破壞生態(tài)系統(tǒng),威脅人類和動(dòng)物的健康生存。 新煙堿類殺蟲劑于20 世紀(jì)90年代開始商品化,是自擬除蟲菊酯類農(nóng)藥商品化后進(jìn)入市場(chǎng)的增長(zhǎng)最快的一類殺蟲劑[4]。 該類化合物的作用靶點(diǎn)是哺乳動(dòng)物和昆蟲膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)中的煙堿乙酰膽堿受體(nAChR),與昆蟲nAChR 的親和力很高,又不被乙酰膽堿酯酶分解,因此使昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)興奮,干擾中樞神經(jīng)信號(hào)的正常傳導(dǎo),殺滅害蟲。

許多農(nóng)藥已被證明具有內(nèi)分泌干擾作用,能夠干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的一種或多種功能,對(duì)生物體和后代造成不利影響[5]。 因此,研究農(nóng)藥的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)具有重要意義。 噻蟲胺(clothianidin, CLO)是一種典型的新煙堿類殺蟲劑,對(duì)害蟲有觸殺、胃毒及內(nèi)吸活性[6]。 CLO 被廣泛應(yīng)用于防治害蟲,如薊馬、粉虱、蚜蟲、潛葉蟲和鞘翅目昆蟲[7]。 因?yàn)樾聼焿A類物質(zhì)對(duì)脊椎動(dòng)物的煙堿乙酰膽堿受體的親和力比較低,所以對(duì)脊椎動(dòng)物的毒性較低[8]。 但已有研究證明新煙堿類殺蟲劑會(huì)對(duì)脊椎動(dòng)物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。例如Pandey 等[9]研究了吡蟲啉染毒對(duì)紅文鳥生殖行為的影響,發(fā)現(xiàn)在繁殖階段,鳴叫和配對(duì)行為逐漸減少直至完全消失。 Caron-Beaudoin 等[10]研究發(fā)現(xiàn),在胚胎聯(lián)合培養(yǎng)模型中的CLO 會(huì)引起細(xì)胞色素P450酶CYP19 的強(qiáng)表達(dá),并影響雌激素的合成。 Wang等[11]對(duì)麗斑麻蜥染毒CLO,發(fā)現(xiàn)CLO 會(huì)在性腺內(nèi)積累并干擾性腺軸相關(guān)基因表達(dá),影響睪酮和雌二醇的濃度。 因此,CLO 可能是潛在的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)。

外源物質(zhì)可以通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG axis)的反饋機(jī)制直接影響內(nèi)源性激素的產(chǎn)生[12]。 睪酮(testosterone,T)和雌二醇(estradiol, E2)是重要的性類固醇激素,主要分泌于性腺中,促進(jìn)性腺成熟,發(fā)展第二性征,對(duì)生殖系統(tǒng)具有重要的調(diào)控意義。 基于此,本研究將 SD 大鼠分別按照50、150 和250 mg·kg-1CLO 的濃度進(jìn)行染毒,通過分析CLO 在大鼠體內(nèi)的富集代謝以及28 d 后對(duì)大鼠性腺組織的損傷情況和血液中性腺激素的變化,探討CLO 對(duì)大鼠HPG 軸的可能影響以初步探討新煙堿農(nóng)藥對(duì)大鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)的干擾作用。

1 材料與方法(Materials and method)

1.1 試劑和儀器

CLO(純度＞98%)購自湖南海利化工有限公司。色譜純級(jí)別的乙腈、甲酸、無水乙醇均購自迪馬科技有限公司(北京)。 Elisa 試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

儀器:TSQ Quantum Access MAX 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技公司,美國(guó));可調(diào)式移液器(艾本德,德國(guó));Sigma 3K15 高速冷凍離心機(jī)(默克,德國(guó));RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,中國(guó))。

1.2 大鼠飼養(yǎng)

成年Sprague-Dawley (SD)大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(京)2016-0006。 大鼠飼養(yǎng)于北京萬合科技有限公司SPF 級(jí)動(dòng)物房中,飼養(yǎng)許可證編號(hào):SYXK(京)2020-0008。 控制大鼠飼養(yǎng)條件為溫度20 ~26℃,光暗比12 h ∶12 h,試驗(yàn)前大鼠進(jìn)行7 d 檢疫觀察,合格大鼠用于試驗(yàn)。 染毒前大鼠隔夜禁食,飲水不限。

1.3 劑量選擇和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

CLO 的大鼠經(jīng)口灌胃 LD50為＞5 000 mg·kg-1,選擇 LD50的 1%(50 mg·kg-1),3%(150 mg·kg-1)和5%(250 mg·kg-1)作為 3個(gè)染毒濃度。 把 CLO 配成混懸液用于灌胃。 把羧甲基纖維素鈉粉末緩慢加入60 ℃蒸餾水中,邊加邊攪拌,配成均一透明的溶液(0.5%羧甲基纖維素鈉),放涼后用于配藥。 CLO 粉末倒入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中超聲,邊加邊攪拌,配成混懸液,灌胃期間持續(xù)攪拌。

48 只大鼠,雌雄各24 只,雌鼠和雄鼠都分別隨機(jī)分成4 組:溶劑對(duì)照組(灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉)、低劑量CLO 組、中劑量 CLO 組和高劑量 CLO 組,共 8 組(雌、雄各 4 組),每組 6 只。 每天經(jīng)口灌胃,持續(xù)28 d 后解剖,取大鼠的腦、肝、性腺(睪丸和卵巢)以及血清保存于-20 ℃,用于檢測(cè)CLO 濃度;一部分性腺保存于4%多聚甲醛溶液中,用于組織病理分析;一部分血清保存于-80 ℃,用于激素水平分析。

1.4 大鼠組織中CLO 濃度分析

在血清和腦、肝、性腺的勻漿中加入10 mL 乙腈,渦旋 3 min,超聲振蕩20 min,然后10 000 r·min-1離心5 min,取上清液。 重復(fù)以上操作,并將上清液合并,在35 ℃用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑蒸干,然后用1 mL 乙腈溶解,通過0.22 μm 微孔過濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

使用TSQ Quantum Access MAX 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技公司),定量分析CLO 含量。 采用 Thermo C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm),柱溫40 ℃,進(jìn)樣量10 μL,流動(dòng)相梯度洗脫條件如表1 所示。 采用電噴霧離子源(ESI),正離子掃描模式,毛細(xì)管溫度350 ℃,毛細(xì)管電壓3 500 V,蒸發(fā)溫度200 ℃,鞘氣流速為207 kPa,輔助氣流速為34 kPa,監(jiān)測(cè)方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM),定性離子對(duì)(m/z)為 250.200/131.966 和 250.200/169.052,定量離子對(duì)(m/z)為250.200/169.052。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase

進(jìn)樣過程進(jìn)行質(zhì)量控制,每15個(gè)樣品測(cè)定一次標(biāo)準(zhǔn)曲線,每5個(gè)樣品之間測(cè)一個(gè)空白樣。

1.5 組織病理學(xué)分析

將解剖得到的大鼠性腺組織剪下一小部分,用4%多聚甲醛固定,切成小塊,放入包埋盒中,用紗布包裹,流水沖洗一晚,用50% ~100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水,加二甲苯透明劑,然后將組織浸蠟。 用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)把包埋好的蠟塊切出4 μm 的切片,用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色,胞核呈藍(lán)色,胞漿呈紅色,紅細(xì)胞呈桔紅色,其他成分呈深淺不同的紅色,用光學(xué)顯微鏡觀察組織病理損傷情況。

1.6 性激素水平的檢測(cè)

把大鼠麻醉后,進(jìn)行腹腔靜脈取血,把血液收集到促凝管中,4 ℃靜置5 min,在4 ℃下4 000 r·min-1離心10 min,取上清液保存于-80 ℃。 使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒檢測(cè)血清中性激素T 和E2 的濃度。 板內(nèi)和板間變異系數(shù)均＜10%,試劑盒測(cè)定的靈敏度T 為0.17 ng·mL-1,E2 為1 pg·mL-1。 用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度OD 值,激素濃度與OD 值負(fù)相關(guān),通過繪制雙對(duì)數(shù)曲線計(jì)算出血清中T 和E2 的濃度。 為了便于分析,激素含量用相對(duì)于對(duì)照組激素濃度的倍數(shù)來表示。

1.7 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

使用SPSS24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析方法比較組間差異。 *P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 CLO 在大鼠腦、肝、性腺和血清中的分布

CLO 染毒28 d 后在腦、肝、性腺和血清中的分布如圖1 所示。 各染毒組的CLO 殘留濃度為:低劑量雄鼠組1.44 mg·kg-1,低劑量雌鼠組1.36 mg·kg-1;中劑量雄鼠組3.20 mg·kg-1,中劑量雌鼠組2.76 mg·kg-1;高劑量雄鼠組64.52 mg·kg-1,高劑量雌鼠組58.09 mg·kg-1。 比較分析 3個(gè)不同劑量染毒組,發(fā)現(xiàn)雄性大鼠體內(nèi)的CLO 濃度一直高于雌性大鼠。低、中劑量組雌雄大鼠各組織中CLO 的濃度從大到小的順序是:血清＞肝臟＞性腺＞腦。 高劑量雌鼠組,雖然CLO 在肝臟中的富集比例明顯減小,但仍保持低、中劑量組的分布規(guī)律。 高劑量雄鼠組,CLO 在各組織中的濃度從大到小的順序是:血清＞性腺＞肝臟＞腦。

圖1 噻蟲胺(CLO)在大鼠血清、腦、肝和性腺組織中的分布Fig.1 Distribution of clothianidin (CLO) in serum,brain, liver and gonad tissues of rat

2.2 性腺組織病理學(xué)

經(jīng)過28 d 的CLO 染毒后,觀察到了大鼠性腺(睪丸和卵巢)的病理學(xué)變化(圖2 和圖3)。 在雄鼠對(duì)照組中,正常的大鼠睪丸組織被膜完整,生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)較為清晰(圖2(a))。 與對(duì)照組相比,低、中劑量染毒組未見異常病變(圖2(b)和2(c)),高劑量組睪丸周邊局部區(qū)域部分曲細(xì)精管可見生精細(xì)胞變性壞死脫落于管腔內(nèi),有的曲細(xì)精管上皮嚴(yán)重變性壞死,腔內(nèi)充滿壞死的無結(jié)構(gòu)紅染的團(tuán)塊(圖2(d))。

圖2 雄性大鼠睪丸細(xì)胞切片注:(a)對(duì)照組;(b) CLO 低劑量染毒組;(c) CLO 中劑量染毒組;(d) CLO 高劑量染毒組;圓圈代表生精細(xì)胞壞死,箭頭代表曲細(xì)精管上皮細(xì)胞壞死。Fig.2 Representative histology of the testis of male ratNote: (a) Control; (b) Low-dose CLO treated group; (c) Medium-dose CLO treated group; (d) High-dose CLO treated group; circle represents necrosis of spermatogenic cells and arrow represents necrosis of seminiferous epithelial cells.

圖3 雌性大鼠卵巢細(xì)胞切片注:(a)對(duì)照組;(b) CLO 低劑量染毒組;(c) CLO 中劑量染毒組;(d) CLO 高劑量染毒組;圓圈代表間質(zhì)血管明顯充血。Fig.3 Representative histology of the ovaries of female ratNote: (a) Control; (b) Low-dose CLO treated group; (c) Medium-dose CLO treated group; (d) High-dose CLO treated group ;circles represent significant congestion of interstitial blood vessels.

雌性大鼠對(duì)照組卵巢皮質(zhì)中有不同數(shù)量的卵泡和黃體,其間為梭形的成纖維細(xì)胞及網(wǎng)狀纖維,髓質(zhì)中有富含血管的疏松結(jié)締組織。 與對(duì)照組相比,低、中劑量組卵巢未見異常病變;高劑量組間質(zhì)血管明顯充血,其余無異常病變。

2.3 血清性激素水平

CLO 染毒28 d 后,不同劑量組血清性激素(T和E2)水平如圖4 所示。 為了便于分析,激素含量用相對(duì)于對(duì)照組激素濃度的倍數(shù)來表示。 雄性大鼠染毒組,T 和E2 濃度均顯著高于對(duì)照組,且中劑量組濃度均顯著高于低劑量組,高劑量組濃度均顯著低于中劑量組,呈現(xiàn)出非單調(diào)劑量效應(yīng)關(guān)系。 雌性大鼠染毒組,低、中劑量組大鼠血清中的T 激素水平與對(duì)照組相比無顯著差異,高劑量組濃度顯著低于對(duì)照組;3個(gè)劑量組大鼠血清中的E2 激素水平與對(duì)照組均無顯著差異。

圖4 CLO 染毒28 d 后血清中性激素睪酮(T)和雌二醇(E2)的含量注:* 相對(duì)于對(duì)照組P＜0.05,a 相對(duì)于低劑量組P＜0.05,b 相對(duì)于中劑量組P＜0.05。Fig.4 Serum concentration of testosterone (T) and estradiol(E2) after CLO exposure for 28 d in male and female ratsNote:* P＜0.05 relative to control, a P＜0.05 relative to low dose, b P＜0.05 relative to medium dose.

3 討論(Discussion)

大鼠連續(xù)28 d 染毒CLO,檢測(cè)肝、腦、性腺和血清中CLO 的濃度,發(fā)現(xiàn)不同劑量的暴露組中,雄鼠體內(nèi)的CLO 濃度一直高于雌鼠,CLO 更容易在雄鼠體內(nèi)富集。 在低(50 mg·kg-1)、中(150 mg·kg-1)劑量組,CLO 在雌、雄大鼠體內(nèi)的殘留量較小,主要分布在血清和肝臟中,各組織中濃度從大到小的順序是:血清＞肝臟＞性腺＞腦。 藥物通過跨膜運(yùn)輸和擴(kuò)散進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng),隨后通過血液的流動(dòng)被輸送到各個(gè)組織中,肝臟內(nèi)具有豐富的氧化還原酶,是許多外源性物質(zhì)解毒的最佳場(chǎng)所,因此大量CLO 被輸送到肝臟中進(jìn)行代謝。 在高劑量組(250 mg·kg-1),CLO 在大鼠體內(nèi)有較高的殘留量,除了血清和肝臟,在性腺中也大量富集,尤其是雄鼠睪丸中,平均濃度達(dá)到14.34 mg·kg-1,超過了肝臟中的濃度,過高的殘留濃度可能會(huì)對(duì)睪丸的正常生理功能造成影響。

在高倍鏡下觀察大鼠性腺組織的切片,與對(duì)照組相比,低(50 mg·kg-1)、中(150 mg·kg-1)劑量組睪丸沒有異常病變(圖2(b)和2(c)),高劑量組(250 mg·kg-1)睪丸嚴(yán)重病變,部分細(xì)胞變性壞死(圖2(d))。組織細(xì)胞發(fā)生壞死后,物質(zhì)代謝停止,功能完全喪失,出現(xiàn)一系列形態(tài)學(xué)改變,壞死是一種不可逆的病理過程,因此250 mg·kg-1CLO 染毒會(huì)對(duì)大鼠睪丸造成病理損傷,從而可能導(dǎo)致生殖障礙,已有研究表明新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉能夠使成年雄性大鼠產(chǎn)生生殖障礙[13-14]。 雌性大鼠3個(gè)染毒組中,卵巢細(xì)胞均無異常病變,CLO 對(duì)雌鼠卵巢正常結(jié)構(gòu)影響不大。

許多環(huán)境污染物通過改變內(nèi)分泌系統(tǒng)的發(fā)育和功能來影響動(dòng)物的繁殖。 暴露此類污染物會(huì)影響性激素水平或阻斷/激活類固醇激素受體,從而對(duì)人類和野生動(dòng)物造成不利的健康后果[10]。 在脊椎動(dòng)物中,性類固醇激素(T 和E2)在睪酮和卵巢中合成、分泌,參與調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)發(fā)育、維護(hù)第二性征等一系列過程。 因此,T 和E2 水平是評(píng)估CLO 染毒對(duì)大鼠性腺影響的重要指標(biāo)。 低(50 mg·kg-1)、中(150 mg·kg-1)劑量CLO 染毒組中,與對(duì)照組相比,雄性大鼠性激素(T 和E2)含量均顯著升高,且中劑量組性激素濃度顯著高于低劑量組,性激素水平與性腺中的CLO 殘留濃度呈現(xiàn)出正相關(guān)的趨勢(shì),說明CLO 染毒促進(jìn)雄鼠性激素合成和分泌。 在高劑量染毒組(250 mg·kg-1)中,雄鼠性激素含量雖然也高于對(duì)照組,但卻不符合低、中劑量組的趨勢(shì),結(jié)合病理學(xué)分析,導(dǎo)致此結(jié)果的原因可能是250 mg·kg-1染毒使雄鼠睪丸部分細(xì)胞壞死,無法進(jìn)行正常的生命活動(dòng),所以高劑量(250 mg·kg-1)CLO 對(duì)雄鼠性激素分泌的促進(jìn)作用有限。 低(50 mg·kg-1)、中(150 mg·kg-1)劑量的CLO 染毒對(duì)雌鼠性激素水平無影響,高劑量(250 mg·kg-1)的CLO 染毒會(huì)使雌鼠血清中T 含量顯著降低,而E2 濃度無明顯變化,說明CLO 染毒可能會(huì)抑制雌鼠T 分泌,而對(duì)E2 作用不顯著。

綜上,在本試驗(yàn)劑量設(shè)置和實(shí)驗(yàn)條件下,3個(gè)劑量CLO 染毒均促進(jìn)雄性大鼠T 和E2 分泌,CLO 高劑量染毒(250 mg·kg-1)會(huì)在雄性大鼠睪丸中大量富集,并導(dǎo)致生精細(xì)胞和曲細(xì)精管上皮細(xì)胞變性壞死,影響大鼠睪丸的正常生理功能;同時(shí)不同劑量CLO染毒不會(huì)對(duì)雌鼠造成明顯的病理損傷,低(50 mg·kg-1)、中(150 mg·kg-1)劑量 CLO 染毒對(duì)雌鼠性激素?zé)o顯著影響,而高劑量CLO 染毒會(huì)抑制雌性大鼠T分泌。 由以上結(jié)果可知3個(gè)劑量CLO 染毒均對(duì)雄性大鼠性腺系統(tǒng)的正常生理功能產(chǎn)生影響,250 mg·kg-1CLO 染毒對(duì)雌性大鼠性腺系統(tǒng)的生理功能可能產(chǎn)生一定影響。 CLO 可能是潛在的內(nèi)分泌干擾物。