高淑芳，張金鵬，施永海，袁新程，劉其根

1. 上海海洋大學/水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質資源重點實驗室，上海 201306

2. 上海市水產(chǎn)研究所/上海市水產(chǎn)技術推廣站，上海 200433

鹽度是影響河口、過河口及海水水生生物生長和發(fā)育的重要環(huán)境因子，與水生生物的性腺發(fā)育關系密切。研究表明，成體金錢魚 (Scatophagus argus)[1]、印度囊鰓鯰 (Heteropneustes fossilis)[2]、紅眼沙鱸 (Psammoperca waigiensis)[3-4]、梭魚 (Liza haematocheila)[5]、凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei)[6]、中華絨螯蟹 (Eriocheir sinensis)[7]等的性腺需要在一定鹽度刺激下才可正常發(fā)育。

刀鱭 (Coilia nasus) 是長江口重要的洄游性經(jīng)濟魚類[8]，主要分布于中國、韓國沿海以及日本的有明海[9-12]，因味道鮮美、肉質細嫩成為重要的經(jīng)濟魚類[13]。近年來由于水體污染、水利興修、資源過度開發(fā)等因素，進入產(chǎn)卵場的刀鱭種群數(shù)量顯著降低，以致不能形成常規(guī)的漁汛[14-15]。鹽度是刀鱭在洄游過程中最直觀的影響因素[16]，研究顯示，進行生殖洄游的魚類須到達特定鹽度才能完成卵巢的正常發(fā)育，才會發(fā)生產(chǎn)卵行為[17]，如鰣(Tenualosa reevesii)、暗紋東方鲀 (Takifugu obscurus)、大麻哈魚 (Oncorhynchus keta) 的性腺發(fā)育和成熟僅在鹽度低于0.5的淡水環(huán)境中進行；而日本鰻鱺 (Anguilla japonica)、松江鱸 (Trachidermus fasciatus)的性腺發(fā)育與繁殖需要鹽度較高的海水環(huán)境[17]。近年，Xu等[18]通過代謝組學對刀鱭卵巢發(fā)育不同步的問題進行了研究，Yin等[19]通過代謝組學研究了刀鱭在產(chǎn)卵遷移過程中能量的消耗和儲存，但未明確指出海、淡水對卵巢發(fā)育的影響。為了更好地保護并合理利用刀鱭資源，需要通過人工養(yǎng)殖來維持其資源量，因此，對刀鱭在人工海、淡水環(huán)境下卵巢發(fā)育機制的研究十分重要。

代謝組學技術作為近年新興的一種高通量測序技術，在各研究領域尤其是環(huán)境對物種的影響中得到廣泛應用[20-22]，代謝組代表生物細胞、組織、器官或生物體中的完整代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物可以通過代謝組學的方法進行測定[23]。關于刀鱭卵巢發(fā)育的代謝組學研究較少，本研究主要通過液相色譜-質譜聯(lián)用 (Liquid chromatograph-mass spectrometer, LC-MS) 的代謝組學技術分析篩選養(yǎng)殖在淡水和海水2種環(huán)境下刀鱭卵巢組織的差異代謝產(chǎn)物，并對差異代謝產(chǎn)物進行代謝通路富集分析，為進一步研究刀鱭在生殖洄游過程中卵巢組織的發(fā)育及其機制以及人工養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗于2018年12月—2019年2月在上海市水產(chǎn)研究所奉賢基地進行，實驗材料選用該基地提供的野生型F3代，Ⅱ齡刀鱭。實驗前將刀鱭放入淡水池中 (長 5 m×寬 3 m×高 1 m) 中暫養(yǎng) 2 周，其后隨機分到淡水組 (實驗組) 和海水組 (對照組，鹽度為25) 水泥池中養(yǎng)殖，每組100尾。海水從河口抽取，鹽度約為9，用日曬鹽將鹽度提高到25。每天08:00、15:00投喂從池塘撈取的活餌 (橈足類、糠蝦等)，每14 d換水1次。

1.2 實驗方法

1.2.1 采樣方法

養(yǎng)殖實驗結束后，停食1 d。將刀鱭置于30 mg·L?1丁香酚溶液中麻醉 5 min后，用干毛巾將魚體表面擦干，取其性腺，一半裝于2 mL的凍存管，迅速置于液氮罐中冷凍，之后于?80 ℃保存以備刀鱭卵巢代謝組學分析；另一半置于Bouin's液中固定24 h，通過石蠟切片和HE染色確定性別后，將海、淡水刀鱭的卵巢分別每3個樣混合，每組6個平行，平均體長為 (21.00±2.67) cm，平均體質量為 (25.80±9.05) g。

1.2.2 樣本處理

稱取刀鱭卵巢樣本 20 mg ，加入 400 μL 提取液 [V(甲醇)∶V(水)=4∶1]，利用高通量組織破碎儀破碎 (?20 ℃, 50 Hz, 6 min)；渦旋 (30 s) 混勻后，低溫超聲萃取 30 min (5 ℃, 40 kHz)；將其置于?20 ℃ 30 min；離心 (13 000×g, 4 ℃, 15 min)，去掉上清液，并加入 100 μL復溶液 [V(乙腈)∶V(水)=1∶1]復溶，同時將所有樣本的提取液等體積混勻制備質控樣本 (Quality control, QC)，每個QC的體積與樣本體積相同。將所測樣本和QC轉移至LC-MS 進樣瓶進行上機分析。本次LC-MS 分析的儀器平臺為AB SCIEX公司的超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質譜UPLC-TripleTOF系統(tǒng)。

1.2.3 色譜條件

實驗采用美國Milford公司BEH C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm,1.7 μm)。配置流動相 A 為水(含0.1% 甲酸)，流動相B 為V(乙腈)∶V(異丙醇)=1∶1 (含0.1%甲酸)，進行梯度洗脫，流速為0.40 mL·min?1，進樣量為 20 μL，柱溫為 40 ℃。

1.2.4 質譜條件

樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式、離子噴霧電壓。質譜檢測范圍為50～1 000 m.z?1。ESI離子源參數(shù)設置霧化氣壓 (GS1) 50 psi；輔助氣壓 (GS2) 50 psi；氣簾氣壓：30 psi；溫度：500 ℃；噴霧電壓：5 000 V (POS模式)或?4 000 V(NEG模式)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

首先采用代謝組學Progenesis QI處理軟件(Waters Corporation, Milford, USA) 過濾質譜數(shù)據(jù)的低質量峰，填充缺失值，歸一化，評估QC樣本RSD，數(shù)據(jù)log轉換預處理。將原始數(shù)據(jù)用Progenesis QI進行搜庫鑒定，將質譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫HMDB和METLIN進行匹配。

采用R軟件包Ropls進行多元統(tǒng)計分析：首先將所有實驗樣品與QC樣品比較后進行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA) 和正交偏最小二乘判別分析 (Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis, OPLS-DA)，再經(jīng) 200 次置換檢驗以判斷模型是否過擬合。

采用t檢驗并結合OPLS-DA分析中的VIP值，篩選出組間的差異代謝物，篩選條件為差異倍數(shù) (Fold-change FC>1)、P(<0.05)和變量投影重要度 (Variable importance in the projection, VIP>1)，三者取交集。代謝通路的注釋分析基于KEGG數(shù)據(jù)庫。

將得到的差異代謝產(chǎn)物在KEGG Compound和HMDB數(shù)據(jù)庫進行化合物分類情況統(tǒng)計。

2 結果

2.1 多元統(tǒng)計分析結果

首先對淡水組 (N=6) 和海水組 (N=6) 的樣品進行PCA和OPLS-DA分析以評估兩組間的統(tǒng)計學差異，發(fā)現(xiàn)所有樣品均處于樣本置信區(qū)間。十字架表示的質控樣本比較集中，說明儀器的穩(wěn)定性好，檢測的數(shù)據(jù)可靠，可用于PCA和OPLS-DA分析。PCA得分結果顯示，淡水組和海水組樣品點在空間上具有明顯的分離，表明兩組間的代謝模式存在差異 (圖1-a)；OPLS-DA分析可看出兩組數(shù)據(jù)的樣品點分別聚為一簇，在空間上呈現(xiàn)分離狀態(tài)，表明淡水組和海水組間產(chǎn)生了顯著差異 (圖1-b)，模型的評價指標R2=0.971，Q2=0.562，說明所構建的模型良好。為進一步驗證模型是否過擬合，采用200次置換檢驗 (圖2)，可知Q2于y軸的截距為負，且置換檢驗得到的R2=0.873 5 和Q2=?0.146 4均小于原始值，由此可見模型沒有過擬合，可以用于后續(xù)差異代謝物篩選的分析。

圖1 海水組和淡水組的主成分分析 (a) 和正交偏最小二乘判別分析 (b) 得分圖Fig. 1 PCA (a) and OPLS-DA (b) scores of seawater and freshwater

圖2 置換檢驗圖Fig. 2 Permutation test

2.2 總代謝產(chǎn)物 Venn 圖

對在陽離子和陰離子2種模式下獲得的海、淡水養(yǎng)殖刀鱭的卵巢代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)分別構建Venn圖(圖3)。在陽離子分離模式下，2組卵巢組織中共有代謝產(chǎn)物310個，其中淡水組中特有代謝產(chǎn)物9個，海水組12個；在陰離子分離模式下，2組共有代謝產(chǎn)物392個，其中淡水組中特有代謝產(chǎn)物也為9個，海水組則降到10個。

圖3 代謝產(chǎn)物Venn圖Fig. 3 Venn map of metabolites

2.3 差異代謝產(chǎn)物注釋

海水和淡水養(yǎng)殖刀鱭卵巢組織樣本中的差異代謝產(chǎn)物的火山圖見圖4，差異代謝產(chǎn)物具體信息詳見表1。與海水組相比，淡水組刀鱭卵巢組織有47個代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出顯著差異性，其中11個代謝產(chǎn)物有上調表達，36個代謝產(chǎn)物有下調表達，表達差異程度最顯著的為碳環(huán)血氧烷A2 (Carbocyclic thromboxane A2)、半乳糖神經(jīng)酰胺 (Galactosyl ceramide)，差異倍數(shù)分別為10.40、2.78倍。根據(jù)表1，淡水組的皮質醇含量比海水組高1.61倍，且呈顯著性差異 (P<0.05)。

圖4 差異代謝物篩選火山圖Fig. 4 Volcanic map of different metabolites

表1 差異代謝物信息表Table 1 Differential metabolites information sheet

將上述47個差異表達代謝產(chǎn)物比對到KEGG數(shù)據(jù)庫進行富集分析，共有8個代謝產(chǎn)物顯著富集到12條KEGG通路上 (圖5和表2)。顯著差異代謝產(chǎn)物的富集通路主要涉及氨酰-tRNA生物合成(Aminoacyl-tRNA biosynthesis)、嘧啶代謝 (Pyrimidine metabolism)、鞘磷脂代謝 (Sphingolipid metabolism)和三羧酸循環(huán) (TCA cycle)。上調表達的2個代謝產(chǎn)物L-脯氨酸 (L-Proline)和L-異亮氨酸 (L-Isoleucine)參與到氨酰tRNA生物合成通路上。下調表達的2個代謝產(chǎn)物尿苷和假尿苷參與到嘧啶代謝通路中。在實驗組卵巢組織中上調表達的半乳糖神經(jīng)酰胺和異檸檬酸 (Isocitrate) 代謝物分別參與到鞘磷脂代謝和三羧酸循環(huán)通路中。

圖5 代謝物的通路富集分析Fig. 5 Metabolite pathway enrichment analysis

表2 差異代謝產(chǎn)物的KEGG通路富集表Table 2 KEGG pathway enrichment table of differential metabolites

將得到的差異代謝產(chǎn)物比對到HMDB數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)占比最多的是脂質和類脂分子，高達41.18%；其次為有機酸及其衍生物，占比35.29%。

將代謝差異物比對到KEGG Compound數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)聚類最多的是氨基酸和羧酸；比對到KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)富集程度最高的分別是脂質代謝通路 (Lipid metabolism)、氨基酸代謝通路和消化系統(tǒng)。

3 討論

通過非靶向代謝組學得到刀鱭卵巢在海、淡水環(huán)境下47種差異代謝物，發(fā)現(xiàn)代謝物主要包括脂質和類脂、有機酸及衍生物、氨基酸及羧酸，這與Xu等[18]對刀鱭卵巢Ⅲ—Ⅴ期發(fā)育過程的研究結果相似，差異代謝物主要涉及糖酵解和糖異生、組氨酸代謝、賴氨酸代謝以及脂肪酸的代謝相關通路。由此可見，海、淡水環(huán)境對人工養(yǎng)殖刀鱭的卵巢發(fā)育具有重要作用。

碳環(huán)血氧烷A2是由活化的血小板在止血過程中產(chǎn)生的，具有凝血之前的特性，也是一種已知的血管收縮劑[24-26]，本實驗淡水組碳環(huán)血氧烷A2高表達可能是刀鱭機體組織為應對進入到淡水中鹽度降低作出的適應性調節(jié)。半乳糖神經(jīng)酰胺是一種強免疫興奮劑，在許多體內實驗模型中顯示出強大的抗腫瘤活性[27]，虹鱒 (Oncorhynchus mykiss) 在洄游產(chǎn)卵期會遇到海水中不同的病毒、細菌等進而增強體內免疫系統(tǒng)[28]，本研究與此類似，刀鱭為應對環(huán)境改變所帶來的免疫脅迫壓力，也會通過增強特殊的免疫通路來完成洄游繁殖進程。

皮質醇是一類類固醇激素，屬于糖皮質激素類，其通過糖異生作用提高血糖水平，也具有抑制免疫系統(tǒng)的功能，有助于脂肪、蛋白質和碳水化合物的代謝[29]。研究表明，在產(chǎn)卵季節(jié)，大麻哈魚的血漿皮質醇水平會有升高現(xiàn)象[30]。皮質醇在薄唇鯔魚 (Liza ramada) 卵巢卵黃形成早期呈下降趨勢，在卵黃中期呈上升趨勢，在卵黃后期下降，在產(chǎn)卵前期上升到較高水平，皮質醇的這種周期性變化支持了卵巢的發(fā)育和產(chǎn)卵[31]。類固醇代謝在卵巢發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，其主要由內分泌腺如精巢、卵巢和腎上腺等單位合成之后釋放到血液循環(huán)中，而所有的類固醇激素均由膽固醇合成，Xu等[18]研究指出，膽固醇合成途徑在刀鱭卵巢發(fā)育過程中 (Ⅲ—Ⅴ期) 逐漸增強。本實驗中皮質醇在淡水環(huán)境下比海水環(huán)境高1.61倍，每年2月初次性成熟的刀鱭開始從沿海區(qū)域進入長江等近海淡水區(qū)進行生殖洄游，在此過程中卵巢逐漸發(fā)育成熟，說明皮質醇在刀鱭洄游過程中參與了卵巢的發(fā)育過程，可能進一步促進了卵巢發(fā)育。此外，魚體內的皮質醇具調節(jié)滲透壓作用，能夠刺激魚類鰓上皮氯細胞密度增加，增強鰓內Na+/K+-ATPase活性，使過多的鹽分排除體外[32-34]，推測皮質醇在刀鱭的洄游過程中參與了滲透壓的調節(jié)。

氨酰-tRNA合成酶在翻譯中的作用是通過準確地將同源tRNA與相應的氨基酸配對來定義遺傳密碼，增強生物體在蛋白質翻譯水平的準確性[35-36]，本實驗中下調的差異代謝物L-脯氨酸和L-異亮氨酸被富集到氨酰-tRNA生物合成代謝通路上，表明刀鱭卵巢組織為適應低鹽度的環(huán)境可能相應地降低了蛋白質的翻譯。同樣下調表達的尿苷和假尿苷2個差異代謝產(chǎn)物富集到嘧啶代謝通路中，該通路的產(chǎn)物 β-氨基丁酸 (β-aminobutyric acid) 可以參與到TCA循環(huán)中[37]，表明淡水養(yǎng)殖環(huán)境下刀鱭卵巢組織內嘧啶類代謝受到部分抑制，甚至可影響能量代謝。刀鱭卵巢組織中鞘磷脂代謝在淡水環(huán)境中得到提升，被富集到該通路的半乳糖神經(jīng)酰胺可穩(wěn)固細胞膜脂質雙分子層的機械穩(wěn)定和化學抗性[38-39]，由此可見，在刀鱭洄游過程中神經(jīng)酰胺類代謝產(chǎn)物在信號轉導和細胞識別中發(fā)揮重要作用。

4 結論

本研究使用LC-MS非靶向代謝組學分析方法，研究了養(yǎng)殖在海、淡水中刀鱭的卵巢組織代謝產(chǎn)物的變化，共篩選得到47種差異代謝產(chǎn)物，推測碳環(huán)血氧烷A2和半乳糖神經(jīng)酰胺的高表達，分別是為了更好地適應環(huán)境變化作出的適應性調節(jié)和增強免疫；淡水環(huán)境下皮質醇大量積累，推測皮質醇在刀鱭的洄游過程中參與了滲透壓調節(jié)，同時可能與卵巢的發(fā)育相關；對差異代謝產(chǎn)物進行KEGG通路富集分析，篩選出氨酰-tRNA生物合成、嘧啶代謝和鞘磷脂代謝3條最顯著的代謝途徑，推測鹽度的變化對刀鱭卵巢組織中的氨基酸、嘧啶、鞘磷脂的合成代謝有較大影響。