林司杭，謝菁菁，林蕾蕾，邱文可，周林，曹雯娟，李明*

（1.廣東藥科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；2.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

隨著近年來(lái)空氣污染日益嚴(yán)重，大氣顆粒物已成為威脅人類(lèi)健康的重要因素，特別是空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于2.5 μm 的細(xì)顆粒物（fine particulate matter,PM2.5）的危害性尤其嚴(yán)重[1]。PM2.5 不僅可以在肺泡沉積干擾呼吸系統(tǒng)的功能，甚至可通過(guò)肺部毛細(xì)血管等途徑進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，引起肺外器官疾病[2]。最近流行病學(xué)和來(lái)自臨床橫斷面的研究表明PM2.5是肝臟疾病的重要致病因素[3]，特別是與非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）密切相關(guān)，如我國(guó)學(xué)者Sun等[3]分析了58026 名臺(tái)灣地區(qū)居民的調(diào)查數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)PM2.5濃度每增加1 μg/mL，NAFLD 發(fā)病率上升1.06%（95%CI：1.04～1.08）[4]，來(lái)自對(duì)國(guó)外居民的調(diào)查也得到了類(lèi)似的結(jié)論[5]。同時(shí)，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示長(zhǎng)期吸入PM2.5 可加速NAFLD 的發(fā)生[6]。我國(guó)是世界上大氣污染最嚴(yán)重的國(guó)家之一，PM2.5 的濃度甚至超過(guò)世衛(wèi)組織標(biāo)準(zhǔn)的幾十倍，這可能是導(dǎo)致我國(guó)NAFLD 發(fā)病率日益增高的原因之一。因此，研究PM2.5 的肝毒性，揭示其致肝病機(jī)理不僅有助于認(rèn)識(shí)大氣污染對(duì)健康的危害性，而且能加深對(duì)NAFLD 發(fā)病原因的了解，具有重要意義。

NAFLD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中以“二次打擊學(xué)說(shuō)”被廣泛認(rèn)可[7]。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為“初次打擊”是指肝內(nèi)胰島素抵抗和脂肪儲(chǔ)積，隨后大量游離脂肪酸在肝臟堆積，導(dǎo)致肝細(xì)胞過(guò)度炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激增強(qiáng)和脂質(zhì)過(guò)氧化造成“二次打擊”，引起肝臟的壞死性炎癥和纖維化，其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是二次打擊中的主要致病機(jī)制[8]。許多研究發(fā)現(xiàn)NAFLD 患者肝臟會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激會(huì)造成脂質(zhì)過(guò)氧化，二者共同作用引起肝臟炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致肝纖維化[9]，抗氧化藥物對(duì)NAFLD 具有保護(hù)作用也證實(shí)了氧化應(yīng)激在NAFLD 發(fā)生發(fā)展中的作用。因此，本文采用不同濃度的PM2.5 對(duì)肝HepG2 細(xì)胞進(jìn)行染毒，檢測(cè)細(xì)胞氧自由基（reactive oxygen species, ROS）和脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量的變化，以及細(xì)胞抗氧化相關(guān)蛋白如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT) 的表達(dá)情況，分析PM2.5 對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，探討PM2.5 引起NAFLD 的機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 試劑與儀器

DCFH-DA（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），Trizol、PrimeScriptTM RT reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa 公司）；總SOD 檢測(cè)試劑盒和MDA 檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；定量PCR 儀器（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 PM2.5 采集

參照Ye 和本室所建立的方法在廣州城區(qū)采集大氣中的PM2.5，加入PBS 制備成PM2.5 樣品混懸液于-80 ℃保存?zhèn)溆肹10-11]。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2 細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞按照說(shuō)明書(shū)，用含10%胎牛血清和1%青鏈雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后繼實(shí)驗(yàn)。

2.3 DCFH-DA 熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平

按2×105/孔將HepG2 細(xì)胞種于6 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁后棄去培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組和低、中、高劑量PM2.5 染毒組（PM2.5 質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50 μg/mL）。根據(jù)分組用PM2.5處理4 h 后，加入10 μmol/L DCFH-DA 避光孵育1.5 h，PBS 洗滌3 次后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.4 細(xì)胞內(nèi)MDA 和SOD 含量的測(cè)定

按2×105/孔將HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到50%融合，按照步驟“2.3”分組并處理細(xì)胞，6 h 后分別根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求收集樣品，依照操作步驟檢測(cè)細(xì)胞MDA和總SOD的含量。

2.5 qRT-PCR 法檢測(cè)SOD1、SOD2 和CAT mRNA的表達(dá)

按2×105/孔將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)后，按照步驟2.2 進(jìn)行分組并處理細(xì)胞。12 h 后用Trizol試劑從HepG2細(xì)胞中提取總RNA,測(cè)定RNA 濃度后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA作為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；然后95℃變性5s，60 ℃退火33 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)為40 個(gè)循環(huán)。所有樣品均以β-actin 為內(nèi)參，結(jié)果用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)變化。引物序列如下：β-actin上游引物：5′-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3′，下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3′；SOD1 上游引物：5′-ATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGC-3′，下游引物：5′-TTATTGGGCGATCCCAATTACACCACAAGCC-3′；SOD2上游引物：5′-CTCCCCGACCTGCCCTACGAC-3′，下游引物：5′-TGCAGGTAGTAAGCGTG-3′；CAT 上游引物：5′-TGAGGTTGAACAGATAGC-3′，下游引物：5′-CACAGGTATATGAAGATAATTG-3′。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行，各組間差異采用方差分析（ANOVA）進(jìn)行均數(shù)間多重比較，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PM2.5對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

結(jié)果如圖1 顯示，與陰性對(duì)照組比較，PM2.5 染毒組細(xì)胞中ROS 的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P<0.05），且隨著PM2.5濃度增大而增強(qiáng)。由此說(shuō)明PM2.5可引起HepG2細(xì)胞ROS生成增多。

圖1 PM2.5對(duì)HepG2細(xì)胞ROS生成的影響（DCFH-DA 熒光探針?lè)ǎ?00×，n=3）Figure 1 Effects of PM2.5 on ROS production in HepG2 cells（DCFH-DA fluorescent probe,×200,±s,n=3)

3.2 MDA和SOD檢測(cè)結(jié)果

與陰性對(duì)照組相比，PM2.5 可使細(xì)胞內(nèi)SOD 的水平顯著下降(圖2A)，同時(shí)使MDA的水平顯著升高(圖2B)，且二者與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明PM2.5 不僅使細(xì)胞脂過(guò)氧化物MDA 生成增多，上調(diào)HepG2 細(xì)胞的氧化水平，同時(shí)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶SOD 含量，抑制肝細(xì)胞的抗氧化能力，最終造成肝細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖2 PM2.5染毒對(duì)HepG2細(xì)胞SOD和MDA含量的影響Figure 2 Effects of PM2.5 on the levels of SOD and MDA in HepG2 cells(±s,n=3)

3.3 PM2.5 對(duì)HepG2 細(xì) 胞SOD1、SOD2 和CAT mRNA表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組比較，PM2.5染毒組SOD1、SOD2和CATmRNA 表達(dá)均明顯下調(diào)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3。本結(jié)果與結(jié)果“3.2”中有關(guān)SOD 的研究結(jié)果一致，表明PM2.5 對(duì)HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響不僅在于促進(jìn)ROS 生成，還與降低細(xì)胞抗氧化能力有關(guān)。

圖3 PM2.5對(duì)HepG2細(xì)胞SOD1、SOD2和CAT mRNA表達(dá)的影響Figure 3 Effects of PM2.5 on the mRNA expression of SOD1、SOD2和CAT in HepG2 cells(±s,n=3)

4 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，每年有近300 萬(wàn)人死于空氣污染相關(guān)的疾病[12]。PM2.5 由于粒徑小，比表面積大，在大氣中懸浮時(shí)間長(zhǎng)的物理特性和容易富集多種有機(jī)物及重金屬的化學(xué)特性，使之更容易進(jìn)入機(jī)體內(nèi)并引發(fā)疾病[13]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，長(zhǎng)期暴露于PM2.5 可能是肝臟疾病發(fā)病率和死亡率增高的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因素[14]。除前述流行病學(xué)研究證實(shí)PM2.5 暴露與NAFLD 相關(guān)外[4]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了二者的聯(lián)系，如Jian[15]等發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)滴注PM2.5可誘導(dǎo)小鼠肝臟出現(xiàn)脂肪變和非酒精性脂肪性肝炎等NAFLD 表現(xiàn)，該結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[16-17]。因此，PM2.5 被認(rèn)為是一種新的NAFLD 致病危險(xiǎn)因素。

體外細(xì)胞模型是研究PM2.5 毒性的常見(jiàn)方法。多個(gè)研究在體外培養(yǎng)肝細(xì)胞，觀察了PM2.5 染毒對(duì)肝內(nèi)細(xì)胞的毒性，如有研究用代謝組學(xué)的方法證實(shí)PM2.5體外染毒導(dǎo)致肝細(xì)胞代謝紊亂[11,18]；還有研究報(bào)道PM2.5 可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[19]；我們前期也發(fā)現(xiàn)證實(shí)PM2.5 通過(guò)激活SREBP-1c 和LXR-α引起肝細(xì)胞脂肪堆積[10]。

氧化應(yīng)激在NAFLD 的起始和進(jìn)展中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。常見(jiàn)肝毒性物質(zhì)引起肝損傷都與氧化應(yīng)激有關(guān)，如乙型肝炎病毒、氰酸鹽、腸源性肝毒物等導(dǎo)致NAFLD 都與ROS 增多相關(guān)[20-21]。同時(shí)研究還顯示抑制ROS 對(duì)NAFLD 具有保護(hù)作用，多種中藥發(fā)揮護(hù)肝作用都與抑制肝臟的氧化應(yīng)激有關(guān)[22-23]。這充分說(shuō)明了氧化應(yīng)激在NAFLD“二次打擊”中的關(guān)鍵作用。

為了證實(shí)PM2.5 對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，本研究首先用DCFH-DA 熒光染色法觀察了PM2.5 染毒肝細(xì)胞ROS 的生成情況，結(jié)果顯示PM2.5 染毒后HepG2 細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量綠色熒光，證實(shí)了肝細(xì)胞受到PM2.5 攻擊后會(huì)產(chǎn)生大量的ROS。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)PM2.5 使肝細(xì)胞內(nèi)MDA 明顯增多。MDA 是ROS與生物膜磷脂中的多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)生成的脂過(guò)氧化產(chǎn)物，不僅反映細(xì)胞受損情況，而且MDA 可加速氧化應(yīng)激反應(yīng)，協(xié)同ROS干擾肝臟內(nèi)細(xì)胞的正常功能。提示PM2.5 染毒促進(jìn)ROS的生成。

SOD 是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì)，其可及時(shí)清除機(jī)體產(chǎn)生的ROS，使得細(xì)胞的氧化/抗氧化維持在一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[24]?？寡趸镔|(zhì)的減少是細(xì)胞氧化應(yīng)激的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)PM2.5干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化損傷酶類(lèi)SOD 含量顯著減少，并進(jìn)一步采用定量PCR 分析其編碼基因SOD1和SOD2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PM2.5 染毒后肝細(xì)胞SOD1和SOD2的表達(dá)也明顯下降，此外結(jié)果還顯示細(xì)胞內(nèi)另一個(gè)主要的抗氧化酶CAT的基因表達(dá)在PM2.5干預(yù)后也明顯降低。這些結(jié)果提示PM2.5不僅促進(jìn)ROS 生成，還可以抑制細(xì)胞的抗氧化能力，最終造成肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，這可能與PM2.5 引起NAFLD有關(guān)。雖然本實(shí)驗(yàn)僅從體外觀察了PM2.5對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，但是最近有研究顯示PM2.5 可引起高脂飲食小鼠肝臟ROS 生成增多從而加速NAFLD 的疾病進(jìn)程[17]，也證實(shí)了我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此推測(cè)氧化應(yīng)激可能是PM2.5 引起NAFLD 的主要機(jī)制之一，后繼我們將建立動(dòng)物模型，以氧化應(yīng)激為靶點(diǎn)研究PM2.5 的具體信號(hào)途徑并尋找防治PM2.5肝毒性的藥物。

綜上所述，本研究在體外初步證實(shí)PM2.5 染毒引起HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激。此外，前期我們和其他研究者發(fā)現(xiàn)PM2.5 可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[26-27]，因此引起機(jī)體氧化應(yīng)激可能是PM2.5 導(dǎo)致包括NAFLD 在內(nèi)的多種疾病的共同途徑，為后繼實(shí)驗(yàn)將以氧化應(yīng)激為靶點(diǎn)尋找抗PM2.5 毒性的防治方法提供了基礎(chǔ)。