寇 蓉，董弘毅，何永吉，邢俊德，范曉軍

（1.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西轉(zhuǎn)型綜合改革示范區(qū)管理委員會，山西 太原 030032；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西功能食品研究院，山西 太原 030031；4.太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030600）

食醋是富有營養(yǎng)的酸性調(diào)味品，能增進(jìn)食欲，且具有食物防腐、除腥及預(yù)防疾病等功能[1]。在我國，傳統(tǒng)食醋釀造是由眾多微生物參與并驅(qū)動谷物原料發(fā)酵，這些微生物因釀造原料[2]、氣候特點(diǎn)[3]、制作工藝等不同而具有多樣性和復(fù)雜性[4-6]。WANG Z M等[7]利用宏基因組方法分析鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵階段微生物時(shí)共鑒定出151個(gè)細(xì)菌屬和202個(gè)真菌屬，其中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是優(yōu)勢細(xì)菌屬，鏈格孢屬（Alternaria）和曲霉屬（Aspergillus）是優(yōu)勢真菌屬。YUN J M等[8]利用高通量測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)涼州熏醋釀造過程中出現(xiàn)25個(gè)細(xì)菌屬和18個(gè)真菌屬，并且優(yōu)勢真菌屬為鏈格孢屬（Alternaria）。微生物群落不僅受到外界環(huán)境因素的影響[9]，群落間的相互作用也塑造了微生物群落結(jié)構(gòu)[10]，共現(xiàn)模式可為研究復(fù)雜微生物環(huán)境的群落結(jié)構(gòu)和功能提供新的視角。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可反映復(fù)雜環(huán)境下占互作主導(dǎo)地位的優(yōu)勢物種、互作緊密的物種群，這些優(yōu)勢物種以及物種群往往對維持復(fù)雜環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定發(fā)揮著獨(dú)特以及重要的作用[11-14]。目前，在人類腸道[15-16]、土壤[17-19]、植物根際[20]和食品發(fā)酵[21-22]等復(fù)雜系統(tǒng)中的微生物共現(xiàn)模式研究已得到了學(xué)者的廣泛關(guān)注。

本研究以山西陳醋釀造過程中不同發(fā)酵階段醋醅為研究對象，采用高通量測序技術(shù)研究食醋微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，并應(yīng)用互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)可視化的軟件Cytoscape 3.7.2構(gòu)建了食醋微生物群落的互作網(wǎng)絡(luò)，揭示山西陳醋釀造過程中的微生物群落相互作用關(guān)系，可為深入認(rèn)識食醋發(fā)酵微生物和食醋發(fā)酵過程控制提供重要理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

醋醅樣品：山西清徐縣某醋廠食醋淀粉糖化（starch saccharification，Sac）發(fā)酵第2天樣品（編號Sac2）、酒精發(fā)酵（alcohol fermentation，AF）第12天樣品（編號AF12）、醋酸發(fā)酵（acetic acid fermentation，AAF）第1天、第3天、第7天和第10天樣品（編號分別為AAF1、AAF3、AAF7、AAF10）。糖化和酒精發(fā)酵階段樣品取自發(fā)酵池的頂部、中部和底部，混合后得到測試樣；醋酸發(fā)酵階段樣品在距離發(fā)酵池表面30 cm的深度進(jìn)行東西南北中五點(diǎn)采集，混合均勻后作為醋酸發(fā)酵階段的測試樣。樣品用無菌密封袋封裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、50×TAE緩沖液（Tris acetate 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），TAE）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）裂解液、溶菌酶：上海生工生物工程股份有限公司；DNA聚合酶、緩沖液：美國NEB公司；GeneJET膠回收試劑盒：美國Thermo Fisher Scientific公司；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京市水光明醫(yī)療儀器有限公司；Neofuge 15R高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；NanoVue plus超微量紫外分光光度計(jì)：英國Cytiva公司；T100梯度PCR儀：美國Bio-Rad公司；Novaseq6000高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組提取與檢測

采用CTAB法[23]對醋醅樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，操作如下：①吸取1 000 μL CTAB 裂解液至2.0 mL EP管里，加入20 μL溶菌酶，將適量的樣品加入裂解液中，65 ℃水?。〞r(shí)間為2～3 h），期間顛倒混勻數(shù)次，以使樣品充分裂解。②離心取950 μL上清，加入與上清等體積的酚（pH 8.0）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。③取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。④吸取上清至1.5 mL離心管里，加入上清液3/4體積的異丙醇，上下?lián)u晃，-20 ℃沉淀。⑤12 000 r/min離心10 min，倒出液體。用1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗滌2次，剩余的少量液體可再次離心收集，然后用槍頭吸出。⑥超凈工作臺吹干或者室溫晾干。⑦加入51 μL雙蒸水（ddH2O）溶解DNA樣品。⑧加RNase A 1μL消化核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），37 ℃放置15 min。之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性并用超微量分光光度計(jì)測定DNA的濃度與純度。

1.3.2 PCR擴(kuò)增與高通量測序

用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）、806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和引物ITS3-2024F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）、ITS4-2409R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）分別擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)和真菌ITS2區(qū)。PCR擴(kuò)增體系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，引物各1.5 μL，基因組DNA（genomic DNA，gDNA）10 μL，ddH2O 2 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進(jìn)行回收和純化。高通量測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.3.3 高通量測序數(shù)據(jù)分析

測序原始序列通過序列拼接、過濾、質(zhì)量控制、去除嵌合體，得到最終有效序列[24-25]。利用Uparse算法（Uparse v7.0.1001）以97%的一致性將所有樣本的有效序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）[26]。用Mothur軟件與SILVA（v138.1）數(shù)據(jù)庫對細(xì)菌OTUs序列進(jìn)行物種注釋分析，用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）與Unite（v8.2）數(shù)據(jù)庫對真菌OTUs序列進(jìn)行物種注釋分析，并分別在門、綱、目、科、屬水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。最后對各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理用于后續(xù)Alpha多樣性分析。

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Observed-OTUs、Shannon、Simpson、Chao1、ACE及Coverage指數(shù)。利用Origin 8.5軟件繪制稀釋曲線和門水平、屬水平物種相對豐度柱狀圖。通過對所有樣本進(jìn)行斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)（Spearman's correlation coefficient，SCC）計(jì)算，得到物種相關(guān)系數(shù)矩陣后，設(shè)置過濾條件如下：①顯著性閾值設(shè)置為0.05；②去除相關(guān)系數(shù)絕對值＜0.6的連接；③過濾掉節(jié)點(diǎn)自連接；④最大物種數(shù)目設(shè)置為50。利用Cytoscape 3.7.2軟件繪圖，以門水平為著色單位可視化山西陳醋釀造過程中細(xì)菌和真菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，其中顯示標(biāo)簽的節(jié)點(diǎn)為平均相對豐度＞1%的菌屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋醅樣品測序數(shù)據(jù)分析

基于高通量測序技術(shù)對醋醅樣品中細(xì)菌和真菌的有效序列和OTUs進(jìn)行研究，結(jié)果見表1。

表1 醋醅樣品中細(xì)菌和真菌的序列信息Table 1 Sequence information of bacteria and fungi in Cupei samples

6個(gè)醋醅樣品共產(chǎn)生384 486條細(xì)菌有效序列，352 791條真菌有效序列。將有效序列以97%的一致性聚類成為OTUs，共得到1 197個(gè)細(xì)菌OTUs和432個(gè)真菌OTUs，并且在各個(gè)發(fā)酵階段細(xì)菌OTUs均大于真菌OTUs，說明醋醅中細(xì)菌群落多樣性遠(yuǎn)高于真菌群落。用Mothur軟件與SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，將所有的細(xì)菌序列鑒定為36個(gè)門、67個(gè)綱、153個(gè)目、238個(gè)科、429個(gè)屬。用BLAST與Unite（v8.2）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，將所有的真菌序列鑒定為8個(gè)門、27個(gè)綱、54個(gè)目、108個(gè)科、168個(gè)屬。

2.2 醋醅樣品Alpha多樣性分析

稀釋曲線直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，山西陳醋釀造過程中醋醅樣品的微生物測序稀釋曲線見圖1。山西陳醋釀造過程中醋醅樣品中微生物的Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果見表2。

圖1 醋醅樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）的稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of bacteria (a) and fungi (b) in Cupei samples

表2 醋醅樣品中細(xì)菌和真菌群落Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes of bacterial and fungal community in Cupei samples

由圖1可知，所有醋醅樣品的稀釋曲線漸近平坦并且Coverage指數(shù)均＞0.99，表明測序可以反映醋醅樣本中絕大多數(shù)微生物群落特征和多樣性信息。

多樣性指數(shù)包括Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，用于表征微生物群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度。微生物群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)越大。豐富度指數(shù)包括Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，用于估計(jì)微生物群落中包含的物種總數(shù)。微生物群落豐富度越高，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)越大。由表2可知，細(xì)菌群落的多樣性和豐富度變化趨勢一致，在酒精發(fā)酵第12天（AF12）有最高的豐富度和多樣性，隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，多樣性和豐富度逐漸下降。真菌群落的多樣性和豐富度整體呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。除醋酸發(fā)酵第7天和第10天外（AAF7、AAF10），細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)高于真菌群落，而在整個(gè)發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均高于真菌群落，表明食醋釀造過程中細(xì)菌群落比真菌群落更具復(fù)雜性。

2.3 醋醅微生物群落結(jié)構(gòu)分析

基于門水平醋醅中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見圖2。

圖2 基于門水平醋醅樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）群落結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Community structure analysis of bacterial (a) and fungal (b) in Cupei samples based on phylum level

由圖2a可知，山西陳醋釀造過程中硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和藍(lán)藻菌門（Cyanobacte ria）是主要的細(xì)菌門（平均相對豐度＞1%），平均相對豐度分別為60.68%、33.78%和3.18%。由圖2b可知，子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是主要的真菌門，平均相對豐度分別為97.46%和1.58%。

基于屬水平醋醅中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，山西陳醋釀造過程中有6個(gè)細(xì)菌屬和8個(gè)真菌屬的平均相對豐度＞1%，其中8個(gè)真菌屬均來自子囊菌門（Ascomycota）。與自然發(fā)酵的谷物醋類似[5，27-29]，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是優(yōu)勢細(xì)菌屬，其平均相對豐度分別為36.06%和23.98%。其中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）隨著發(fā)酵的進(jìn)行相對豐度逐漸降低，在醋酸發(fā)酵第10天（AAF10）降低至5.33%。相反，醋酸桿菌屬（Acetobacter）的相對豐度隨著發(fā)酵的進(jìn)行不斷增加，在醋酸發(fā)酵第10天（AAF10）增加至64.56%。此外，魏斯氏菌屬（Weissella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、unidentified_Mitochondria和unidentified_Chloroplast也是食醋釀造過程的主要菌屬。unidentified_Mitochondria和unidentified_Chloroplast僅在醋酸發(fā)酵第1天（AAF1）具有較高的相對豐度，分別為23.62%和17.41%，表明其是在酒精發(fā)酵結(jié)束后，酒醅與輔料、老醅混合后引入的，并且不適應(yīng)醋酸發(fā)酵環(huán)境導(dǎo)致相對豐度很快降低。

圖3 基于屬水平醋醅樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）群落結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Community structure analysis of bacterial (a) and fungal (b) in Cupei samples based on genus level

復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）是醋醅中的優(yōu)勢真菌屬，其平均相對豐度為49.75%。已有研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)江香醋和山西老陳醋釀造過程中的優(yōu)勢真菌屬是酵母菌屬（Saccharomyces）[27，29-30]，涼州熏醋釀造過程中的優(yōu)勢真菌屬是鏈格孢屬（Alternaria）[8]，這些差異可能是由地理氣候、釀造原料和工藝等因素造成。此外，布氏白粉菌屬（Blumeria）、枝孢屬（Cladosporium）、明梭孢屬（Monographella）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、鏈格孢屬（Alternaria）和哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）也是食醋釀造過程中的主要真菌屬，平均相對豐度分別為8.74%、4.98%、4.84%、3.48%、1.98%和1.55%。

2.4 醋醅中微生物群落互作網(wǎng)絡(luò)分析

醋醅樣品中細(xì)菌、真菌群落的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析分別見圖4和圖5。

圖4 醋醅樣品中細(xì)菌群落的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Correlation network analysis of bacterial community in Cupei samples

圖5 醋醅樣品中真菌群落的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析Fig.5 Correlation network analysis of fungal community in Cupei samples

由圖4可知，細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)包括50個(gè)節(jié)點(diǎn)，182條邊，網(wǎng)絡(luò)密度為0.074，聚集系數(shù)為0.304，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為7.280，正相關(guān)關(guān)系占87.36%。細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)中，48%的節(jié)點(diǎn)來自硬壁菌門（Firmicutes），36%的節(jié)點(diǎn)來自變形菌門（Proteobacteria），43.48%的拮抗作用來自醋酸桿菌屬（Acetobacter）。隸屬于變形菌門（Proteobacteria）的醋酸桿菌屬（Acetobacter）與硬壁菌門（Firmicutes）的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）具有顯著的拮抗性，這可能是由于醋酸桿菌屬（Acetobacter）代謝的乙酸逐漸積累抑制其他菌屬的生長。乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）存在協(xié)同作用，unidentified_Mitochondria和unidentified_Chloroplast呈正相關(guān)。微生物之間的協(xié)同作用表明這些微生物在食醋釀造環(huán)境中有共同的營養(yǎng)和環(huán)境偏好，或通過代謝物交換形成相互依賴的模式。

由圖5可知，真菌互作網(wǎng)絡(luò)包括50個(gè)節(jié)點(diǎn)，246條邊，網(wǎng)絡(luò)密度為0.1，聚集系數(shù)為0.304，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)9.84，以正相關(guān)關(guān)系占主導(dǎo)，占比達(dá)88.62%。根據(jù)以上結(jié)果推論，在食醋釀造過程中，微生物群落的互作以協(xié)同作用為主；真菌互作網(wǎng)絡(luò)具有更復(fù)雜的連接。真菌互作網(wǎng)絡(luò)中68%的節(jié)點(diǎn)來自子囊菌門（Ascomycota），30%的節(jié)點(diǎn)來自擔(dān)子菌門（Basidiomycota），57.14%的拮抗作用來自復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）。復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）與鏈格孢屬（Alternaria）存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，枝孢屬（Cladosporium）與布氏白粉菌屬（Blumeria）、鏈格孢屬（Alternaria）存在顯著正相關(guān)關(guān)系，酵母菌屬（Saccharomyces）和哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）存在協(xié)同作用。

3 結(jié)論

本研究基于高通量測序技術(shù)研究了山西陳醋釀造過程中醋醅微生物群落的結(jié)構(gòu)以及互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，醋醅中細(xì)菌群落多樣性遠(yuǎn)高于真菌群落。醋醅中優(yōu)勢細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter），并且乳酸桿菌屬（Lactobacillus）隨著發(fā)酵的進(jìn)行豐度逐漸降低，而醋酸桿菌屬（Acetobacter）則相反。細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)分析表明，醋酸桿菌屬（Acetobacter）貢獻(xiàn)了43.48%的拮抗作用，其中醋酸桿菌屬（Acetobacter）與乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）具有顯著的拮抗性；乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）存在協(xié)同作用。醋醅中的優(yōu)勢真菌屬為復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）。真菌互作網(wǎng)絡(luò)分析表明，57.14%的拮抗作用來自復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），并且復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）與鏈格孢屬（Alternaria）存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究從共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)視角探究了山西陳醋釀造過程中的復(fù)雜微生物群落結(jié)構(gòu)演替特征，并提出了可能的互作模式，既豐富了釀造微生物信息數(shù)據(jù)，也可為食醋釀造過程控制和開發(fā)復(fù)配醋曲提供重要的參考數(shù)據(jù)。