辛肇晨，吳 茜，BANG SOYEON，王 紅，楊子昂，張宏偉

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普通外科，上海 200032

乳腺癌是全球發(fā)病率最高的腫瘤之一，占女性新發(fā)癌癥總數(shù)的24.5%［1］。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與激素、肥胖、遺傳等多種因素有關(guān)。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cAMP-response element binding protein 1, CREB1）是亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子CREB/ATF家族的一員，可被多種蛋白激酶磷酸化，進(jìn)而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄過程［2-3］。CREB1與肺癌［4］、腎癌［5］和膠質(zhì)瘤［6］的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但CREB1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響鮮見報(bào)道。

本研究通過構(gòu)建CREB1表達(dá)沉默的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231，采用Western印跡、CCK-8實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察CREB1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，旨在為乳腺癌的診療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑和儀器 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和人腎上皮細(xì)胞系HEK293T購(gòu)于美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）。胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu) 于 美 國(guó)Gibco公 司（16140063、11995065、15090046）；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司（SH30256.01B）。攜帶短發(fā)夾RNA（shRNA）序列的pLKO.1載體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Lipo3000試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司（L3000015）；NP-40裂解液、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)于海門碧云天生物技術(shù)研究 所（P0013F、C1052）；BCA蛋 白 定 量 試 劑盒 購(gòu) 于 美 國(guó)Thermo公 司（23227）。CREB1、GAPDH、Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6一 抗，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)于 美 國(guó)CST公 司（9197、5174、55506、18048、12790、13331、7074）；CCK-8試劑盒、Caspase 3、 Bcl-2、Survivin、Bax一 抗 購(gòu) 于 英 國(guó)Abcam公司（ab228554、ab32351、ab32124、ab76424、ab32503）。ECL Western印跡試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司（E412-01）；Transwell小室和BD Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自北京明陽(yáng)科華生物科技有限公司（353097、354480）。酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀購(gòu)自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系用含10%FBS和100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞分為shSCR組（空載質(zhì)粒）、shCREB1#1組和shCREB1#2組。

1.3 載體構(gòu)建及慢病毒轉(zhuǎn)染 用Lipo3000將shRNA-pLKO.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，用慢病毒感染HEK293T細(xì)胞后，收集病毒液，轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞。用嘌呤霉素篩選7 d后，獲得穩(wěn)定沉默CREB1的乳腺癌細(xì)胞系。shRNA的序列見表1。

表1 shRNA序列

1.4 Western印跡和RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率 Western印跡：使用NP-40裂解液提取總蛋白，通過BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育，4℃搖床過夜；第2天回收，經(jīng)TBST洗膜后，于室溫下用二抗孵育 1 h，用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白條帶。

RT-PCR：CREB1及GAPDH的PCR引 物 如表2所示。配置20 μL反應(yīng)體系，設(shè)定兩步法RTPCR程序，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)副孔；讀取樣本光密度（D）值。

表2 RT-PCR引物序列

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以100 mL/孔接種于96孔板中，使每孔含細(xì)胞3000～5000。每個(gè)細(xì)胞系設(shè)置夠5 d測(cè)量的副孔，將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后棄去3個(gè)副孔中的培養(yǎng)基，加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育2 h后，測(cè)定450 nm處的D值。

1.6 集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞以600個(gè)/孔接種于6孔板并使細(xì)胞分散均勻，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。待孔板中形成肉眼可見的克隆時(shí)，棄上清液，用PBS清洗，陰干，甲醇固定。加適量結(jié)晶紫染色20 min，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種至6孔板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化并收集，4℃下200×g離心5 min，收集細(xì)胞懸液。用70%冷乙醇固定細(xì)胞18 h，用PBS洗滌2次。每個(gè)試管加入500 μL PI/RNase染液，混勻，室溫下避光孵育20 min后置于冰上，并于1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 鋪板、制備單細(xì)胞懸液過程同上。用冰PBS洗滌細(xì)胞2次后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到流式管中，離心，棄上清。加入300 μL的Annexin Ⅴ Binding Buffer懸浮細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混勻，避光，室溫孵育15 min。 上機(jī)前5 min加入5 μL的PI染色，并補(bǔ)加200 μL的Annexin Ⅴ Binding Buffer。根據(jù)Annexin Ⅴ和PI的染色情況篩選出凋亡細(xì)胞。

1.9 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白 采用Western印跡檢測(cè)CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1、Bcl-2、Survivin、Caspase 3、Bax蛋白的表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)步驟同上。

1.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 用馬克筆在六孔板背后劃線，每隔1 cm劃一道，每孔至少有5條線穿過。每孔鋪約5×105個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)副孔，培養(yǎng)過夜。用移液槍頭在六孔板內(nèi)按照馬克筆標(biāo)記垂直劃線，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。將六孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于 8 h、24 h后拍照并計(jì)算劃痕閉合率。

1.11 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)前，先用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，制備單細(xì)胞懸液。在Transwell小室上層加入300 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育2 h。在上層小室中加入100 μL細(xì)胞懸液，在下層小室中加入600 μL 含10%FBS的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h后取出，用5%戊二醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察、拍照，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)除須在接種細(xì)胞前將BD Matrigel基質(zhì)膠置于上層小室并培養(yǎng)24 h外，余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPad Prism繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié)果

2.1 CREB1表達(dá)沉默細(xì)胞株的鑒定 結(jié)果 （圖1）顯 示，shRNA干 擾 后，shCREB1#1組 和shCREB1#2組中MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系CREB1的mRNA和蛋白水平均低于shSCR組（P＜ 0.001），提示CREB1沉默細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖1 RT-PCR和Western印跡檢測(cè)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中CREB1的表達(dá)A、C：MCF-7細(xì)胞系；B、D：MDA-MB-231細(xì)胞系。n＝3, ±s；***P＜0.001。

2.2 沉默CREB1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2A）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力均明顯減弱（P＜ 0.001）。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2B、2C）顯示，沉 默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì) 胞 的克隆數(shù)減少（P＜0.001）。

圖2 沉默CREB1對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖和集落形成的影響A：CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；B、C：集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆數(shù)。n＝3, ±s； ***P＜0.001。

2.3 沉默CREB1對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞分析結(jié)果（圖3A）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的G1期細(xì)胞占比增多，而S期細(xì)胞占比減少（P＜0.05）。同時(shí)，Western印跡結(jié)果（圖3B）顯示，沉默CREB1后，MCF-7細(xì)胞中CDK2、CDK4和CDK6的表達(dá)量降低，MDA-MB-231細(xì) 胞 中CDK2、CDK4、CDK6和Cyclin D1的表達(dá)量降低。

圖3 沉默CREB1對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞細(xì)胞周期的影響A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞G1期、S期、G2期細(xì)胞占比；B：Western印跡檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。n＝3, ±s; *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.4 沉默CREB1對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞分析結(jié)果（圖4A）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率升高（P＜ 0.05）。Western印跡結(jié)果（圖4B）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì) 胞 的 促 凋 亡蛋白Caspase3、Bax的表達(dá)水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá)水平降低（P＜0.05），其中以shCREB1#2組的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化更明顯。

圖4 沉默CREB1對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；B：Western印跡檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。n＝3, ±s; *P＜0.05，**P＜0.01， ***P＜0.001。

2.5 CREB1沉默對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.5.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 結(jié)果（圖5）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì) 胞 劃 痕8 h和24 h后的愈合率降低（P＜0.05）。

圖5 沉默CREB1對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響n＝3, ±s; *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.5.2 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 結(jié)果（圖6）顯 示，沉 默CREB1后，MCF-7和MDAMB-231細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量均減少（P＜0.05）。

圖6 沉默CREB1對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的影響A、B：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)；C、D：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。Original magnification:×200。n＝3, x± s; *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

3 討論

CREB1于1987年首先由Montrminy等從大鼠腦組織中分離純化出來(lái)［7-8］。近年來(lái)，CREB1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。CREB1作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以與多種靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)，包括CDK4、Cyclin D1和Cyclin A等細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白［9］。在膠質(zhì)瘤中，CREB1可通過激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路促進(jìn)Cyclin D1、Bcl-2的表達(dá)，而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并抑制凋亡［10-11］。過表達(dá)CREB1可抵抗miR-133a-3p對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的促凋亡作用［12］。

本研究中，沉默CREB1可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的增殖能力減弱，G1/S期阻滯以及CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1表達(dá)水平下降，提示CREB1可能在乳腺癌細(xì)胞的增殖過程中起關(guān)鍵作用。而且，沉默CREB1還引起乳腺癌細(xì)胞的凋亡增加，凋亡蛋白Caspase 3、Bax的表達(dá)水平升高而促生存因子Bcl-2、Survivin的表達(dá)水平降低，表明CREB1可能參與乳腺癌細(xì)胞凋亡信號(hào)的調(diào)控。盡管本研究Western印跡結(jié)果中MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化與MDA-MB-231細(xì)胞并不完全一致，但與沉默CREB1抑制乳腺癌細(xì)胞周期和促進(jìn)其凋亡的結(jié)論一致。關(guān)于CREB1調(diào)控乳腺癌增殖和凋亡過程的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

腫瘤細(xì)胞遷移是一個(gè)復(fù)雜的、多因素調(diào)控的過程。該過程除受外部因素影響外，還與腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)有關(guān)［13-15］。細(xì)胞遷移和侵襲的發(fā)生與細(xì)胞間黏附減少和細(xì)胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)。E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-CAD）在上皮細(xì)胞胞間連接中起重要作用，當(dāng)E-CAD缺乏時(shí)，上皮細(xì)胞會(huì)具有間充質(zhì)細(xì)胞的特性，其流動(dòng)性大幅增強(qiáng)［16］。 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族是與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以降解多種細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［17］。本研究細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默CREB1可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱，表明CREB1與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)。但本研究未進(jìn)一步測(cè)定E-CAD和MMPs等蛋白的表達(dá)水平，后續(xù)可通過Western印跡、RT-PCR、ELISA等方法測(cè)定相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，并對(duì)遷移和侵襲的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行探索。

目前有關(guān)CREB1與乳腺癌關(guān)系的研究多側(cè)重于CREB1作為中介因子對(duì)其他腫瘤相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用［18-19］，而CREB1調(diào)控的下游靶基因眾多，這些靶基因?qū)θ橄侔┥飳W(xué)行為的影響仍需進(jìn)行研究。本研究通過沉默CREB1基因，抑制了CREB1調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的“總閘門”作用，證明CREB1表達(dá)的降低可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為乳腺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。未來(lái)可補(bǔ)充體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，在動(dòng)物模型中對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。