槲皮素是一種五羥基黃酮，來源廣泛，具有多種生物學活性和很高的藥用價值。實驗證明，黃酮類化合物對自由基、超氧陰離子均有良好的清除作用，除了抗炎作用，槲皮素還具有抗菌、抗病毒、抗糖尿病、免疫調節(jié)和心血管保護等作用，并有新的藥理作用，比如抗抑郁、抗衰老等。

酪氨酸酶（EC1.14.18.1，Tyrosinase）普遍存在于微生物、動植物和人體中，具有雙重催化作用，在生物體內是黑色素合成的關鍵酶，同時與人的衰老、昆蟲的發(fā)育及傷口愈合、果蔬的褐變都有著密切關系。本文以L-多巴為底物，采用酶抑制動力學法研究了槲皮素對酪氨酸酶的抑制特性及類型，結果表明，槲皮素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制常數(shù)KI為2.23mg/mL，屬于競爭性抑制劑，這對于開發(fā)槲皮素為抗氧化劑并研究其對馬鈴薯酪氨酸酶活性的影響具有指導性意義。

一、材料與儀器

1.實驗材料。馬鈴薯、槲皮素、L-DOPA、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉。

2.實驗儀器。FA2004型分析電子天平、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、XW-80A漩渦混合儀、MK3酶標儀、KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器、冷凍干燥離心機以及超低溫離心機。

二、實驗與方法

1.酪氨酸酶提取液的制備。稱取去皮切碎馬鈴薯（-20℃冷凍過夜），按1：5（m/V）的比例加入磷酸鹽緩沖液2mL，用震蕩機震蕩1min后離心處理，倒出上清液。

2.酶活力的測定方法。配置濃度為25Mm、pH為6.8的磷酸鹽緩沖溶液，將底物L-多巴溶解在上述磷酸鹽溶液中，配置成濃度為0.8mg/mL的L-多巴溶液。取一個96孔板，先加入40μL上述L-多巴溶液，再加入80μL磷酸緩沖液（濃度25mM，pH6.8），立即放在震蕩器上震蕩，使其混合均勻。加入40μL馬鈴薯酪氨酸酶的磷酸緩沖溶液（25mg/mL，25mM，pH6.8）開始反應，在波長492nm下測定溫孵前后每孔的吸光度。然后將96孔板在30℃條件下溫孵20min，并在波長492nm下測定溫孵后每孔的吸光度。

3.探究酶活力測定的最適條件。選取底物濃度、pH、馬鈴薯酪氨酸酶液提取時間、酶液加入量、反應溫度這5個與酶活力相關的因素，探究酶活力測定的最適條件。分別配置濃度為0.40mg/mL、0.80mg/mL、1.20mg/mL、1.40mg/mL、2.0mg/mL的L-多巴溶液，測定酶活力;分別在試管中加入pH值為5.8、6.2、6.8、7.2、7.6、8.0的磷酸鹽緩沖液，測定酶活力;分別設定0h、0.5h、1.0h、2.0h、3.0h的馬鈴薯酪氨酸酶提取時間，按照上述方法測定酶活力;取0.5g液氮冷凍后的馬鈴薯粉末，加入1.0mL磷酸鹽緩沖溶液（25mM，pH6.8），等梯度稀釋，酶液濃度分別為0.5g/mL、0.25g/mL、0.125g/mL、0.0625g/mL、0.03125g/mL，測定酶活力;加入酪氨酸酶提取液后，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的不同溫度水浴條件下測定酶活力。

4.槲皮素對馬鈴薯酪氨酸酶活力影響的測定及抑制率的計算。在96孔板中加入L-多巴（6mmol/L）及磷酸鹽緩沖液（pH6.8），充分混勻，在30℃水浴中溫育10min后加入40μL不同質量濃度（0mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL）的槲皮素溶液，然后加入30μL酶提取液，立即充分混勻，測定OD492nm。具體操作如表1所示。

抑制率公式為：抑制率（%）=[（A-B）-（C-D）]/（A-B）x100

在上式中，A表示溫孵后空白孔在波長492nm下的吸光度，B表示溫孵前空白孔在波長492nm下的吸光度，C表示溫孵后樣品孔在波長492nm下的吸光度，D表示溫孵前樣品孔在波長492nm下的吸光度。

三、結果與分析

1.酶活力測定的最適條件。選取底物濃度、pH、酪氨酸酶液提取時間、酪氨酸酶液加入量、反應溫度這5個酪氨酸酶活性的影響因素，探究酶活力測定的適宜條件。（1）當?shù)孜餄舛葹?.4mg/mL-2.0mg/mL時，酶活力隨著底物濃度的增大而增加，達到1.2mg/mL后，隨著底物濃度的增加，酶活力增加較為緩慢，故選擇1.2mg/mL為最適底物濃度。（2）當pH為5.8-6.8時，酶活力隨著pH的增大而增加;當pH小于6.8時，酶活力相對降低，故選擇pH6.8為最適條件。但當pH大于7.6時，酶活力有一定的回升，需要考慮同工酶因素，并根據(jù)實驗確定具體酶的類型。（3）馬鈴薯酪氨酸酶液儲存在4℃冰箱中，2.0h內酶活力變化不大，但在2.0h后酶活力降低。因此，酶提取液應在2h內用完，在此時間內使用酶提取液，酶活力變化對實驗結果造成的影響較小。（4）當酪氨酸酶提取液濃度小于0.25g/mL時，酶活力與酶液濃度基本呈線性關系。當酶液濃度大于0.25g/mL時，酶活力增長緩慢，說明酶提取液已近飽和，故選擇0.25g/mL勻漿為最佳濃度。（5）酪氨酸酶在30℃時活力最高，溫度升高或降低，酶活力均下降（圖1）。

底物濃度、pH、酪氨酸酶液提取時間、酪氨酸酶液加入量、反應溫度這5因素對酪氨酸酶的活性均有一定影響。當?shù)孜餄舛葹?.2mg/mL，酪氨酸酶液提取后2h內，酪氨酸酶液濃度為0.25g/mL，溫孵溫度為30℃，pH為6.8時，為酶活力測定的適宜條件。由于酪氨酸酶是從馬鈴薯中自提的，所以得到的最適條件會存在不同。因此本實驗選用同一批馬鈴薯提取出的酪氨酸酶，并在較短時間內用完，盡可能減小實驗誤差。

2.槲皮素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制動力學分析。在測酶活體系中，固定加入酶量，改變底物L-多巴的濃度，測定酶在不同濃度抑制劑下的催化活力。以酶反應的初速度的倒數(shù)對底物濃度Cs作圖，為一組雙曲線，說明酶促反應遵循米氏動力學方程（表2）。以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，可以判斷槲皮素對該酶的抑制作用類型，結果如圖2所示，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖在一組現(xiàn)行坐標點相交，直線橫軸截距隨槲皮素質量濃度的改變而發(fā)生改變，而縱軸截距保持不變，表現(xiàn)為競爭型抑制。二次作圖，以斜率對槲皮素質量濃度作回歸直線（圖3），可以求出槲皮素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制常數(shù)（KI）為2.23mg/mL。

四、討論與結論

本研究分析了酶液加入量、底物濃度、溫度等單個因素對馬鈴薯酪氨酸酶活力的影響，結果發(fā)現(xiàn)每個因素對酪氨酸酶的活性均存在不同程度的影響。酶活力測定的適宜條件為：底物濃度1.2mg/mL、酪氨酸酶液濃度0.25g/mL、反應溫度30℃、pH6.8。本研究顯示，槲皮素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制作用類型為競爭型抑制，槲皮素因為結構與底物L-多巴相似，能夠與酪氨酸酶的活性中心結合，通過與底物競爭，導致酶活力下降，其對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制常數(shù)為2.23mg/mL。

槲皮素是酪氨酸酶抑制劑，馬鈴薯內的酪氨酸酶同樣受到槲皮素的抑制影響。管驍?shù)炔捎玫睦野彼崦甘羌兤罚緦嶒炇褂玫睦野彼崦甘邱R鈴薯提取物，純酶和粗酶的酶活力不同，對相同底物的影響也不同。同時，馬鈴薯內酪氨酸酶的提取過程受到多種因素影響，比如溫度、pH等，最終導致的結果是，與槲皮素對酪氨酸酶純品的抑制率相比，槲皮素對馬鈴薯提取酪氨酸酶的抑制率較低。

本文通過酶抑制動力學實驗，研究了槲皮素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制特性及其機理。結果表明，槲皮素是馬鈴薯酪氨酸酶的競爭性抑制劑，抑制常數(shù)為2.23mg/mL，該研究可以為酪氨酸酶競爭性抑制劑的分子設計提供一定的參考依據(jù)。

作者簡介：王露逸（1993-），女，漢族，山東青島人，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)及檢驗。