崔子杰 劉丹飛 陳思源 蒲玉梅 鐘云飛

湖南工業(yè)大學(xué) 包裝與材料工程學(xué)院 湖南 株洲 412007

1 研究背景

近年來，食品安全問題受到廣泛關(guān)注。食品安全與食品質(zhì)量密切相關(guān)，而食品的質(zhì)量則與食品特性、貯藏溫度、貯藏時(shí)間有顯著的關(guān)系。相比于檢測最終產(chǎn)品質(zhì)量，人們更應(yīng)該關(guān)注食品在整個(gè)生命周期中的實(shí)時(shí)監(jiān)測關(guān)鍵參數(shù)[1-3]。時(shí)間-溫度指示劑（timetemperature indicator，TTI）作為一種新興的智能可識別技術(shù)，是一種成本低、變化不可逆的食品質(zhì)量記錄工具，通常附著在食品或食品包裝上。

在食品生產(chǎn)—儲存—運(yùn)輸過程中，TTI 可對整個(gè)過程的溫度積累效應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測和記錄，并以自身顏色變化與被包裝食品的貨架期相對應(yīng)，從而顯示食品品質(zhì)的變化和剩余貨架壽命信息[4-6]。根據(jù)TTI中顏色變化工作原理的不同，TTI可分為物理型、化學(xué)型、微生物型及酶型四大類[7]。物理型TTI主要通過反應(yīng)物的物理變化使指示劑產(chǎn)生色彩變化，典型的如Monitor Mark型TTI，此TTI根據(jù)酯質(zhì)擴(kuò)散速度隨溫度升高而加快的原理設(shè)置，通過酯質(zhì)擴(kuò)散長度或范圍判斷被指示食品的新鮮程度[8]?；瘜W(xué)型TTI主要通過反應(yīng)物的聚合反應(yīng)使指示劑產(chǎn)生色彩變化，如張嘉帥[9]根據(jù)2, 4-己二炔-1, 6-二烷基脲在溫度、輻射等外界條件的刺激下會發(fā)生不可逆的固相化學(xué)聚合反應(yīng)從而產(chǎn)生顏色變化的原理，制成化學(xué)型TTI并應(yīng)用于疫苗冷鏈的實(shí)時(shí)監(jiān)控。微生物型TTI主要通過微生物的生長代謝使反應(yīng)體系的pH值[10]或底物成分[11]發(fā)生變化，結(jié)合pH指示劑達(dá)到指示效果。酶型TTI[12]則根據(jù)酶與底物反應(yīng)生成可變色物質(zhì)，配合顯色指示劑達(dá)到顏色變化的效果。相較于其他型TTI，酶型TTI具有性能穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低、可控性好的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于牛乳、酸奶、冷鮮肉、魚類等冷鏈產(chǎn)品的貨架期指示，但目前酶型TTI多制備成液態(tài)形式，在實(shí)際應(yīng)用中易發(fā)生泄漏，污染產(chǎn)品[2]。

固態(tài)TTI因具有易于儲存與應(yīng)用、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前的固態(tài)TTI主要是使用聚乙烯醇或瓊脂制作緩釋薄膜[13-14]，或利用靜電紡絲技術(shù)[15-17]、微膠囊技術(shù)[18]達(dá)到固定化的效果。微膠囊技術(shù)作為一種將微量物質(zhì)包裹在聚合物薄膜中的微型包裝技術(shù)，可以有效減少活性物質(zhì)對外界環(huán)境因素（如光、氧、水）的反應(yīng)，有效控制芯材的釋放，從而達(dá)到提高反應(yīng)體系穩(wěn)定性的效果[19-20]。酶對溫度、pH值的變化較為敏銳，將微膠囊技術(shù)應(yīng)用在酶的固定化上，會使酶型TTI具有更好的儲存穩(wěn)定性[21-23]。

脂肪酶型TTI在酶型指示劑中占有重要地位，但目前對于固態(tài)脂肪酶TTI的研究相對較少。本研究采用離子凝膠技術(shù)制備脂肪酶微膠囊，通過單因素試驗(yàn)考察海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、氯化鈣濃度對脂肪酶微膠囊活性的影響，并通過正交工藝法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，得到最佳制備工藝條件；進(jìn)一步通過控制外界環(huán)境變量，得到脂肪酶微膠囊反應(yīng)的最適溫度及pH值，并初步應(yīng)用于TTI。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與試劑

1）原料：脂肪酶，酶活力為20 000 U/g，上海源葉生物有限公司。

2）試劑：殼聚糖，生物試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；海藻酸鈉，生物試劑，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸，分析純，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；無水氯化鈣，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酚酞，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯醇1799型，分析純，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；三乙酸甘油酯，分析純，上海源葉生物有限公司；氫氧化鈉，分析純，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，分析純，湖南匯虹試劑有限公司；磷酸二氫鉀，分析純，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；十二水磷酸氫二鈉，分析純，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水，購于屈臣氏。

2.2 儀器與設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101S型，上海力辰邦西儀器科技有限公司；分析電子天平，F(xiàn)A2004型，上海良平儀器儀表有限公司；冷凍干燥機(jī)，SCIENTZ-12N型，寧波新芝生物科技股份有限公司； 掃描電子顯微鏡，PHenom ProX型，中國賽默飛世爾科技有限公司；離子濺射儀，SBC-12型，北京中科科儀股份有限公司；可調(diào)高速勻漿機(jī)，F(xiàn)SH-2A型，常州億能實(shí)驗(yàn)儀器；傅里葉紅外光譜測試儀，TENSOR II型，德國布魯克光譜儀器公司；pH計(jì)，pH-100型，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

2.3 脂肪酶微膠囊的制備及工藝優(yōu)化

2.3.1 脂肪酶微膠囊的制備

稱取1 g脂肪酶，用10 mL水溶解，靜置分層，過濾取濾液；稱取一定量的海藻酸鈉，加入脂肪酶溶液中，磁力攪拌15 min，得到海藻酸鈉脂肪酶溶液；稱取一定量的殼聚糖，用100 mL乙酸溶液溶解，磁力攪拌15 min，得到殼聚糖溶液；稱取一定量的氯化鈣，加入殼聚糖溶液中，磁力攪拌5 min，得到殼聚糖氯化鈣混合溶液；使用10 mL注射器將海藻酸鈉脂肪酶溶液滴入殼聚糖氯化鈣混合溶液中，攪拌直至完成成膜反應(yīng)，過濾，冷凍干燥，獲得脂肪酶微膠囊[21-22]。

2.3.2 脂肪酶的活性測定

脂肪酶微膠囊的水解活力采用GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中的通用測定方法進(jìn)行測定，并得到脂肪酶微膠囊的酶活回收率，選取脂肪酶微膠囊的最佳制備方案。

脂肪酶活力的計(jì)算公式為：

式中：X1為樣品的酶活力，U/g；V1為滴定空白時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為滴定樣品時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；n1為樣品的稀釋倍數(shù)。

酶活回收率的計(jì)算公式為：

式中：X1為脂肪酶微膠囊的酶活力，U/g；X0為原脂肪酶的酶活力，U/g。

2.3.3 脂肪酶微膠囊制備的單因素試驗(yàn)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中, 發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、氯化鈣濃度等3 個(gè)因素對脂肪酶微膠囊活性可能存在影響，故以海藻酸鈉質(zhì)量濃度（20, 30, 40 g/L）、殼聚糖質(zhì)量濃度（3, 6, 9 g/L）、氯化鈣濃度（0.1, 0.2, 0.3 mol/L）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并測定脂肪酶微膠囊的水解活性。上一單因素試驗(yàn)結(jié)束后，選取其中最佳的因素水平作為條件進(jìn)行下一單因素試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)平行3次，探究各因素對脂肪酶微膠囊活性的影響[18,24]。

2.3.4 脂肪酶微膠囊制備的正交法工藝優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)考察海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、氯化鈣濃度3 個(gè)因素對脂肪酶微膠囊活性的影響，采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)正交法工藝優(yōu)化試驗(yàn)，并測定脂肪酶微膠囊的水解活性。每個(gè)試驗(yàn)平行 3 次，通過極差分析確定各因素對脂肪酶微膠囊活性的影響，得到最優(yōu)制備工藝。

2.4 外界環(huán)境對脂肪酶微膠囊性能的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)得到脂肪酶微膠囊的最優(yōu)制備工藝，制備脂肪酶微膠囊。比較所得脂肪酶微膠囊與原脂肪酶的熱穩(wěn)定性能、最適溫度及pH值，探究微膠囊化處理對脂肪酶的影響。

2.4.1 脂肪酶的熱穩(wěn)定性

其他條件不變的情況下，將原脂肪酶與脂肪酶微膠囊在60 ℃下水浴中分別加熱0, 30, 60, 90, 120 min，再采用GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中通用測定方法測定脂肪酶的活性，得到其熱穩(wěn)定性能變化情況。

2.4.2 反應(yīng)溫度對脂肪酶活力的影響

其他條件不變的情況下，分別在反應(yīng)溫度為20,30, 40, 50, 60 ℃的環(huán)境中，采用GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中通用測定方法對原脂肪酶與脂肪酶微膠囊的活性進(jìn)行測定，得到脂肪酶活力隨反應(yīng)溫度的變化情況。

2.4.3 反應(yīng)溶液pH值對脂肪酶活力的影響

其他條件不變的情況下，分別在緩沖溶液pH值為6, 7, 8, 9, 10的環(huán)境中，采用GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中通用測定方法對原脂肪酶與脂肪酶微膠囊的活性進(jìn)行測定，得到脂肪酶活力隨pH值的變化情況。

2.5 脂肪酶微膠囊理化性質(zhì)分析

2.5.1 紅外光譜分析

分別稱取海藻酸鈉、殼聚糖、原脂肪酶、脂肪酶微膠囊各2 mg，各加入100 mg溴化鉀進(jìn)行研磨壓片，105 ℃烘干處理，然后采用TENSOR II傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描分析，掃描范圍為400～4000 cm-1。

2.5.2 粒徑分布分析

使用Nano Measurer粒徑分布計(jì)算軟件統(tǒng)計(jì)微膠囊在未干燥形態(tài)和干燥形態(tài)下的粒徑分布情況，并計(jì)算其平均粒徑。

2.5.3 形貌及結(jié)構(gòu)分析

準(zhǔn)備完整的微膠囊顆粒及粉碎后的微膠囊顆粒，分別對微膠囊的外部形貌與內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析。具體操作方法為：在樣品架上貼一層導(dǎo)電膠帶，然后將微膠囊均勻平鋪在導(dǎo)電膠帶上，使用SBC-12離子濺射儀噴灑一層薄金后, 用PHenom ProX 掃描電子顯微鏡對待測樣品的形貌/結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

2.6 脂肪酶微膠囊在TTI上的初步應(yīng)用

1）原理。根據(jù)脂肪酶水解脂肪產(chǎn)生脂肪酸使反應(yīng)體系pH值產(chǎn)生變化的原理，選取適當(dāng)?shù)膒H指示劑與反應(yīng)物作為變色底物，再加入脂肪酶微膠囊，使得反應(yīng)過程中體系內(nèi)pH值變化引起顏色變化，從而達(dá)到指示效果。

2）具體方法。選取脂肪酶微膠囊的最優(yōu)制備工藝得到的微膠囊酶顆粒，粉碎后過200目篩；在pH=10.6的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液中加入瓊脂加熱溶解，冷卻后加入三乙酸甘油酯作為底物，酚酞-百里酚酞-百里香酚藍(lán)混合指示劑作為變色指示劑，得到變色底物。取1 mL變色底物置入一次性培養(yǎng)皿中，冷卻凝固；另取冷卻后的瓊脂溶液加入微膠囊0.05 g，取0.5 mL置于一次性培養(yǎng)皿中，冷卻凝固；將底物瓊脂片與脂肪酶微膠囊瓊脂片接觸以激活脂肪酶TTI體系，用聚乙烯膜將指示劑體系密封置于4 ℃環(huán)境下保存，在同一光源下觀察其顏色變化。

3 結(jié)果與分析

3.1 脂肪酶微膠囊的制備工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)中，分別以海藻酸鈉質(zhì)量濃度（A）、殼聚糖質(zhì)量濃度（B）、氯化鈣濃度（C）為變量進(jìn)行試驗(yàn)，并對得到的脂肪酶微膠囊的水解活性進(jìn)行測定，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

表1 單因素試驗(yàn)及酶的活性測定Table 1 Single factor test and enzyme activity determination

由表1可以看出，這3種變量對微膠囊的活性均有影響。隨著海藻酸鈉和殼聚糖濃度的增大，脂肪酶微膠囊的活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這說明所選取的因素水平范圍合適，可用作正交試驗(yàn)中的水平范圍；隨著氯化鈣濃度的增大，脂肪酶微膠囊的活性也隨之上升，但氯化鈣濃度達(dá)到0.2 mol/L后，再增大氯化鈣濃度對酶活性的影響則相對較小。

殼聚糖作為微膠囊壁材，能與海藻酸鈉溶膠發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成殼聚糖-海藻酸鈉聚電解質(zhì)復(fù)合膜。適當(dāng)?shù)臐舛饶軌蚴刮⒛z囊的外部壁材形態(tài)更加穩(wěn)固，從而對內(nèi)部的脂肪酶起到更好的固定作用，但濃度過高會導(dǎo)致微膠囊壁過厚，內(nèi)部的脂肪酶很難通過壁材，從而降低了其活性。海藻酸鈉濃度和氯化鈣濃度對微膠囊酶的活性影響可能是因?yàn)楹Ｔ逅徕c作為微膠囊芯材，與氯化鈣發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，海藻酸鈉中的鈉離子與氯化鈣中的鈣離子發(fā)生置換，形成海藻酸鈣網(wǎng)狀水凝膠結(jié)構(gòu)，對脂肪酶起載體作用，適當(dāng)?shù)臐舛饶軌蚴怪久父泳鶆虻姆稚⒃谛静闹?，但海藻酸鈉濃度過大會導(dǎo)致溶液流動性變差，無法通過注射器擠出均勻的球狀溶液，從而使包裹微膠囊壁材過程變得十分困難。

為了獲得脂肪酶微膠囊的最佳制備工藝，對單因素試驗(yàn)后進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化工藝。采用L9（34）正交法，以海藻酸鈉質(zhì)量濃度（A）、殼聚糖質(zhì)量濃度（B）、氯化鈣濃度（C）為變量，并設(shè)置空白變量組，對得到的脂肪酶微膠囊的水解活性進(jìn)行測定，并對測定結(jié)果進(jìn)行極差分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 2 Orthogonal experiment results and range analysis

由表 2 可看出，k2A＞k3A＞k1A，k2B＞k1B＞k3B，k3C＞k2C＞k1C，因此A2、B2、C3分別是A、B、C三因素的最優(yōu)水平；RB＞RC＞RA表明殼聚糖濃度對脂肪酶微膠囊的活性影響最大，其次是氯化鈣濃度，海藻酸鈉濃度影響最小。因此，通過正交試驗(yàn)獲得的脂肪酶微膠囊制備最優(yōu)工藝組合為A2B2C3，即海藻酸鈉質(zhì)量濃度為30 g/L，殼聚糖質(zhì)量濃度為6 g/L，氯化鈣濃度為0.3 mol/L。

3.2 生物催化性能分析

3.2.1 脂肪酶微膠囊的熱穩(wěn)定性能

酶作為一種對溫度十分敏感的生物試劑，高溫存儲會使其活性明顯降低，而酶的固定化可以有效解決酶的熱變性問題。本研究分別將原脂肪酶與脂肪酶微膠囊在60 ℃下水浴中加熱一段時(shí)間，并研究兩種酶的活性隨時(shí)間的變化情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 脂肪酶在60 ℃環(huán)境下的熱穩(wěn)定性Fig. 1 Thermal stability of lipase at 60℃

由圖1可知，在60 ℃儲存條件下，原脂肪酶的水解活性迅速降低，2 h后的活性僅為初始活性的26.67%；而脂肪酶微膠囊的水解活性降低速率明顯下降，在2 h后仍有初始活性的57.96%。這可能是因?yàn)槲⒛z囊壁材對芯材有一定的保護(hù)作用，且固定化載體的存在阻止了部分脂肪酶分子的伸展變形以及分子變性。對脂肪酶進(jìn)行微膠囊化處理，有效提高了原脂肪酶的熱穩(wěn)定性能。

3.2.2 外界環(huán)境對脂肪酶微膠囊活性的影響

脂肪酶作為一種酶制劑，對外界的環(huán)境十分敏感，因此外界環(huán)境如反應(yīng)溶液pH值、反應(yīng)溫度等對脂肪酶的活性都會產(chǎn)生影響。本研究通過控制反應(yīng)溶液的pH值、反應(yīng)溫度，得到原脂肪酶與脂肪酶微膠囊活性隨溶液pH值及反應(yīng)溫度的變化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 外界環(huán)境對脂肪酶活力的影響Fig. 2 Effect of external environment on lipase activity

由圖2a可知，原脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃左右，脂肪酶微膠囊的最適溫度則在50 ℃左右，這也進(jìn)一步證明了脂肪酶微膠囊熱穩(wěn)定性的提高。由圖2b可知，原脂肪酶在pH=8左右的水解活性最強(qiáng)，而脂肪酶微膠囊的水解活性在pH=9～10左右時(shí)最強(qiáng)，這說明微膠囊化后的脂肪酶耐堿性更好，更適合在堿性條件下反應(yīng)。由此說明，微膠囊化處理使脂肪酶的耐堿性及耐高溫性能都有一定的提升。

3.3 物理和形態(tài)特征分析

3.3.1 紅外光譜分析

脂肪酶微膠囊、原脂肪酶、海藻酸鈉、殼聚糖的紅外光譜圖如圖3所示，其中：A為脂肪酶微膠囊；B為原脂肪酶；C為殼聚糖；D為海藻酸鈉。

圖3 脂肪酶微膠囊紅外光譜圖Fig. 3 Infrared spectrum of lipase microcapsules

由海藻酸鈉紅外光譜圖（圖3D）可知，由于C== O鍵的不對稱伸縮振動引起1614 cm-1處的寬峰，C== O鍵的對稱伸縮振動引起1417 cm-1處的窄峰；1030 cm-1處的寬峰則是由于C—O鍵伸縮振動引起的。殼聚糖紅外光譜（圖3C）中3450 cm-1左右的峰，是形成氫鍵締合的—OH伸縮振動吸收峰與—NH的伸縮振動吸收峰重疊而增寬的多重吸收峰；在1600 cm-1及1656 cm-1處，由于N—H彎曲振動和C==O伸縮振動形成酰胺吸收峰。原脂肪酶（圖3B）在3440 cm-1處的吸收峰，與—OH鍵軸向變形有關(guān)；1610 cm-1處的峰與N—H鍵的彎曲振動有關(guān)；1420 cm-1處的峰與C—N鍵軸向變形有關(guān)；1160 cm-1處的峰與C—O鍵軸向變形有關(guān)。對于脂肪酶微膠囊（圖3A），可以觀察到微膠囊—OH鍵和—NH鍵的伸縮振動吸收峰強(qiáng)度降低，且移動至3340 cm-1處，C—O鍵軸向變形相關(guān)的峰（1013 cm-1處）吸收強(qiáng)度也有所減弱，可能是殼聚糖中的氨基和海藻酸鈉中羧基的離子間及靜電相互作用導(dǎo)致N—H鍵減少。有研究發(fā)現(xiàn)，如果形成包埋物，芯、壁材分子間的非共價(jià)鍵作用會減弱分子間的鍵能，體現(xiàn)在紅外光譜中相應(yīng)基團(tuán)的吸收強(qiáng)度會相應(yīng)減弱，依此來表征壁材分子是否對芯材產(chǎn)生了包埋作用[24-25]。比較譜圖4A～B可以看出，脂肪酶微膠囊的吸收峰強(qiáng)度有所減弱, 這表明脂肪酶進(jìn)入了微膠囊內(nèi)腔，實(shí)現(xiàn)了微膠囊對脂肪酶的包埋作用。

圖4 脂肪酶微膠囊粒徑分布Fig. 4 Particle size distribution of lipase microcapsules

3.3.2 粒徑分布分析

利用Nano Measurer粒徑分布計(jì)算軟件統(tǒng)計(jì)脂肪酶微膠囊在未干燥形態(tài)和干燥形態(tài)下的粒徑分布情況，并計(jì)算其平均粒徑，結(jié)果如圖4所示。由圖4a可知，未干燥的微膠囊粒徑主要分布在3.0～4.0 mm左右，平均粒徑約為3.58 mm；由圖4b可知，干燥后的微膠囊粒徑主要分布在1.6～2.4 mm左右，平均粒徑約為1.95 mm。

3.3.3 形貌及結(jié)構(gòu)分析

利用掃描電子顯微鏡觀察脂肪酶微膠囊的外部形貌、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及粉碎后的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。由圖5a可以觀察到，微膠囊顆粒為表面坍塌不均勻的球體。這是由于在水凝膠基微膠囊的形成過程中，水分子通過分子排列及二次力存在于微膠囊中，使微膠囊呈現(xiàn)出均勻的球形；但在冷凍干燥過程中，由于水分子的消失與基體結(jié)構(gòu)的減弱，這種穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，因此干燥后微膠囊不再是一個(gè)均勻的球體，表面會出現(xiàn)坍塌與褶皺，內(nèi)部則形成大量的孔洞[20-22]。由圖5b可以觀察到微膠囊顆粒內(nèi)部呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這是由于海藻酸鈉中的鈉離子與氯化鈣中的鈣離子會發(fā)生置換反應(yīng)，形成海藻酸鈣網(wǎng)狀水凝膠結(jié)構(gòu)。圖5c微膠囊粉碎后的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，可以看到脂肪酶附著在微膠囊內(nèi)壁上。

圖5 脂肪酶微膠囊掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 Scanning electron microscopy of lipase microcapsules

3.4 脂肪酶微膠囊在TTI上的初步應(yīng)用分析

通過正交試驗(yàn)得到脂肪酶微膠囊的最優(yōu)制備工藝，即在海藻酸鈉質(zhì)量濃度30 g/L、殼聚糖質(zhì)量濃度6 g/L、氯化鈣濃度0.3 mol/L的條件下制備脂肪酶微膠囊，并進(jìn)一步制備TTI，用聚乙烯膜將指示劑體系密封，置于4 ℃環(huán)境下保存，在同一光源下每隔8 h觀察其顏色變化，結(jié)果如圖6所示。

圖6 脂肪酶微膠囊TTI的顏色變化過程Fig. 6 Color change process of lipase microcapsule TTI

彩圖

由圖6可以看出，隨著時(shí)間的推移，此TTI的顏色發(fā)生紫色-淡紫色-黃色的變化過程，24 h后再無顏色變化，反應(yīng)終止。在本TTI體系中，使用甘氨酸-氫氧化鈉溶液作為緩沖溶液，初始pH值在10.6左右。當(dāng)TTI激活后，脂肪酶微膠囊水解變色底物中的三乙酸甘油酯，產(chǎn)生脂肪酸，使得TTI體系中的pH值緩慢下降。酚酞-百里酚酞-百里香酚藍(lán)混合指示劑作為TTI體系中的pH指示劑，可在pH=10.6～8.0的范圍內(nèi)對體系pH值的變化做出顏色響應(yīng)，得到一個(gè)可視化的變色效果，當(dāng) TTI體系的pH值下降到8.0后，顏色不再發(fā)生變化，此TTI體系達(dá)到指示終點(diǎn)。

本研究中制備的酶型TTI體系，將變色底物與脂肪酶微膠囊分別固定化，并采取接觸激活的方式，有利于TTI反應(yīng)體系初始反應(yīng)時(shí)間的控制，不存在必須現(xiàn)做現(xiàn)用的問題；且在固定化過程中，本研究先對脂肪酶進(jìn)行了微膠囊化處理，使得脂肪酶在儲存和反應(yīng)過程中的穩(wěn)定性更好，再對整個(gè)TTI反應(yīng)體系進(jìn)行固定化，使TTI更易存儲及應(yīng)用。從該應(yīng)用實(shí)驗(yàn)可以看出，本實(shí)驗(yàn)制備的脂肪酶微膠囊可以應(yīng)用于TTI的研究中，對于固態(tài)TTI的研究有一定的幫助。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可以通過改變TTI體系內(nèi)各組分的含量，達(dá)到縮短或增長反應(yīng)時(shí)長的目的，從而應(yīng)用于指示不同食品的品質(zhì)變化及貨架期。

4 結(jié)語

本研究采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合優(yōu)化脂肪酶微膠囊的制備工藝，得出理論最佳工藝為海藻酸鈉質(zhì)量濃度30 g/L、殼聚糖質(zhì)量濃度6 g/L、氯化鈣濃度0.3 mol/L，在此條件下，制備的脂肪酶微膠囊水解活性最高。相比于原脂肪酶，本研究制備的脂肪酶微膠囊的熱穩(wěn)定性有所提高，最適溫度和pH值也有所改變，使得脂肪酶耐堿性更好，更適合在堿性條件下反應(yīng)。

通過紅外光譜分析和掃描電子顯微鏡觀察可知，脂肪酶的特征吸收峰強(qiáng)度有所減弱，表明脂肪酶進(jìn)入了微膠囊內(nèi)腔，包埋成功；微膠囊的外部形貌為不均勻球體，呈現(xiàn)出塌陷和不均勻的表面，內(nèi)部則是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以使脂肪酶更加均勻地附著在微膠囊內(nèi)壁，且不阻礙脂肪酶與外界反應(yīng)。

本研究對制備的脂肪酶微膠囊在時(shí)間-溫度指示劑中進(jìn)行了初步應(yīng)用，制備的TTI隨時(shí)間呈現(xiàn)明顯的顏色變化，為脂肪酶微膠囊在TTI方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。在后期的研究中，將進(jìn)一步完善該微膠囊在固態(tài)TTI體系中的應(yīng)用與分析。