張 涵 張爾珂 周貴寅 張玉平 鄧新輝 譚 平

湖南工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院 湖南 株洲 412007

0 引言

重金屬對水體及土壤的污染也日益成為人們關(guān)注的問題[1]。調(diào)查顯示，全國土壤重金屬總超標(biāo)率為16.1%，污染類型以無機型為主，土壤及水體重金屬離子主要有鉛、汞、鎘等8種[2-5]。采礦污染土地面積已達(dá)200余萬公頃，并且每年以（3.3～4.7）萬公頃的速度遞增[6]。西南地區(qū)土壤中，鎘、鉛、鋅、銅、砷等背景值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全國土壤背景值[7-10]。因此，研究土壤中重金屬對植物生長的影響可為解決當(dāng)前環(huán)境污染問題提供依據(jù)。

植物的根系直接與土壤相接觸，植物對重金屬有較強的富集能力[11-12]。當(dāng)土壤中重金屬濃度較高時，植物根系對重金屬的富集作用會受到抑制，同時其生長發(fā)育也會受到影響[13-15]。雙龍等[16]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中重金屬濃度過高會降低植物根系的含水量。P. Sharma等[17]的研究表明，當(dāng)重金屬的含量超過作物閾值，會對植物體內(nèi)相關(guān)酶造成影響，進(jìn)而影響植物生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致植物死亡。在重金屬脅迫下，植物生長狀況惡化，根系生長受到抑制、根系體積減小，根鮮重降低[16]、根系活力減小，最終導(dǎo)致其產(chǎn)量、質(zhì)量降低，生物多樣性減少[17-20]。M. Jamla等[21]研究發(fā)現(xiàn)不同種類植物對重金屬的耐受能力不同，木本植物對重金屬有較強的耐性。國內(nèi)外對重金屬危害植物的研究層出不窮，但對重金屬脅迫下，植物生長機理的研究相當(dāng)有限。

鑒于洋蔥根系對重金屬鉛、鎘較為敏感[22]，本研究采取水培試驗的方法，以洋蔥為供試植物，在模擬重金屬鉛、鎘污染條件下，分析重金屬類型和濃度對洋蔥根系生長狀況的影響，利用顯微鏡觀察重金屬Pb、Cd在不同濃度下對洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂過程、細(xì)胞核形態(tài)的影響，通過測定吸光度值和顯色反應(yīng)的方法評估重金屬鉛、鎘對過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力[23]等的影響。綜合不同濃度重金屬鉛、鎘對洋蔥根系生長狀況、有絲分裂過程、酶活力大小等各項生理指標(biāo)的影響，初步探討重金屬對洋蔥根系的影響機制，闡明洋蔥對重金屬鉛鎘脅迫下的生理響應(yīng)機制，為重金屬對植物生長機理的影響和重金屬污染土壤的生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 供試植物

供試植物選取大小、生長狀態(tài)基本一致，較新鮮，無病蟲害及腐爛現(xiàn)象，符合實驗要求的新鮮紫皮洋蔥，購于湖南省株洲市蔬菜市場。試驗前先用自來水將洋蔥根部表面的土壤和污漬洗去，避免破壞洋蔥的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，再用蒸餾水潤洗1～2次。

1.2 實驗試劑、設(shè)備與儀器

1）實驗試劑

硝酸鉛（Pb(NO3)2）、硝酸鎘（Cd(NO3)2）、酒精（體積分?jǐn)?shù)為70%）、鹽酸（體積分?jǐn)?shù)為10%）、Carnoy固定液（甲醇與冰乙酸體積比為3:1）、磷酸緩沖液、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫、硫酸，以上試劑均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。去離子水，實驗室自制。

2）實驗設(shè)備與儀器

超純水處理系統(tǒng)，YK-RO-B型，上海和泰儀器有限公司；加熱磁力攪拌器，HJ-85-2型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；高速離心機，TG16G型，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，HH-2型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；精密電子天平，BSM120.4型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡，xsp-01型，上海浦丹光學(xué)有限公司；紫外-可見分光光度計，通用T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限公司。

1.3 實驗方法

將兩種重金屬試劑Cd(NO3)2和Pb(NO3)2配制成不同濃度的水溶液，共設(shè)置9個實驗組，將去離子水作為空白對照組；每個濃度設(shè)置3個平行實驗，采用水培法培養(yǎng)洋蔥，共30個樣品。每天上午八點至九點統(tǒng)計每個洋蔥根的數(shù)量，并對洋蔥每條根的長度進(jìn)行測量并記錄。7 d后收集不同重金屬濃度下培養(yǎng)的洋蔥根尖，觀察洋蔥根尖的有絲分裂情況，并對過氧化物酶和過氧化氫酶活力進(jìn)行測定。

1.4 觀察與測定方法

1）洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的觀察。剪下洋蔥根尖約0.5 cm，置于固定液中固定20 min后轉(zhuǎn)入酒精中，放置片刻將根尖取出，水洗后放入盛有少量10%鹽酸的小燒杯中，并置于60 ℃恒溫水浴鍋中解離8 min，直至根尖發(fā)白變軟。用鑷子將根尖伸長區(qū)部分取出，在盛有清水的玻璃皿中漂洗后，置于載玻片上。夾住根尖，用解剖針或刀片在根尖乳白色部分0.3 cm處剔除1/3至1/2，然后放在載玻片中央，將所取的材料充分研磨、并用醋酸洋紅染液染色，用解剖針將組織分散，染色5～20 min。吸去多余染液，蓋上蓋玻片，在蓋玻片上放2層吸水紙，對準(zhǔn)標(biāo)本扣壓，使細(xì)胞和染色體鋪展開。先用低倍鏡觀察洋蔥根尖壓片，選擇分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)至視野中央，利用高倍鏡進(jìn)行觀察，拍照記錄觀察結(jié)果。

2）過氧化物酶活力的測定。稱取洋蔥根系1 g，量取5 mL 20 mmol/L KH2PO4溶液置于研缽中研磨、勻漿，以4000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，收集上清液保存在冷處，殘渣用5 mL KH2PO4溶液提取一次，合并兩次提取液，取上清液。在比色皿中加入3 mL愈創(chuàng)木酚反應(yīng)混合液，1 mL KH2PO4溶液作對照；另一比色皿中加入3 mL反應(yīng)混合液與1 mL酶液，立即用秒表計時，在紫外-可見分光光度計470 nm處測定吸光度值，每隔1 min測定一次，并記錄數(shù)據(jù)，以每分鐘內(nèi)吸光度變化為一個酶活力單位（U）。

3）過氧化氫酶活力的測定。取足量洋蔥根系，加入少量pH=7.8的磷酸緩沖溶液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)至管中，10 000 r/min離心12 min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。取若干小試管，加入2.5 mL酶液，再加入2.5 mL 0.1 mol/L H2O2，于30 ℃恒溫水浴中反應(yīng)10 min，立即加入2.5 mL 10% 硫酸溶液停止反應(yīng)，用0.1 mol/L高錳酸鉀溶液滴定，至出現(xiàn)粉紅色（30 s內(nèi)不消失）為終點，停止滴定并記錄消耗的KMnO4溶液體積，酶活力用每克鮮重樣品在10 min內(nèi)分解H2O2的毫升數(shù)表示，酶活力計算參照實驗教材的通用公式。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)利用Excel 2003進(jìn)行平均值計算，利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件Origin對洋蔥根系長度和生長時間進(jìn)行Logistics生長模型擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬對洋蔥根系生長狀況的影響

2.1.1 重金屬對洋蔥根系形態(tài)的影響

為了研究重金屬類型和濃度對洋蔥根系生長狀況的影響，在不同濃度Pb、Cd下觀察洋蔥根系的生長情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同溶液中洋蔥根系的生長狀態(tài)Fig. 1 Growth situation of onion roots in different solutions

由圖1可知，不同濃度的Pb(NO3)2及Cd(NO3)2溶液中洋蔥根系主要出現(xiàn)了以下4種具有代表性的現(xiàn)象：圖1a在60 mg/L的Cd(NO3)2、2000 mg/L的Pb(NO3)2溶液中，部分洋蔥根系表面發(fā)黑，根系短而粗；圖1b在20 mg/L Cd(NO3)2溶液中洋蔥的根尖變黃變彎曲；圖1c在40 mg/L的Cd(NO3)2、1000 mg/L 的Pb(NO3)2溶液中，部分洋蔥根系出現(xiàn)變黃、變軟、變透明彎曲等現(xiàn)象；圖1d在3000 mg/L的Pb(NO3)2溶液中，部分洋蔥出現(xiàn)了根部腐爛的現(xiàn)象。這是由于鉛對根尖細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重毒害，高濃度Pb(NO3)2使洋蔥根系腐爛，高濃度的Cd(NO3)2加速根尖細(xì)胞木質(zhì)化[24-25]。洋蔥對重金屬鉛、鎘脅迫均較為敏感，可作為重金屬鉛、鎘的監(jiān)測植物。

2.1.2 重金屬對洋蔥根系長度的影響

不同濃度Cd(NO3)2溶液中，一周內(nèi)洋蔥根系長度變化如表1所示。

表1 不同濃度Cd(NO3)2中洋蔥根系長度Table 1 Root length of onion in Cd(NO3)2 with different concentrations

由表1可知，隨著Cd(NO3)2濃度的增大，洋蔥根系平均長度均減小，且與對照組相差越大。當(dāng)Cd(NO3)2質(zhì)量濃度為60 mg/L時，培養(yǎng)1 d后根系長度與對照組的相差2.725 mm，第2～7 d分別相差4.627,6.408, 10.603, 15.756, 20.196, 20.940 mm，時間越長根長差別越大。從組內(nèi)來看，對照組7 d內(nèi)根系平均生長速率為3.308 mm/d，當(dāng)Cd(NO3)2質(zhì)量濃度為20,40, 60 mg/L時，洋蔥根系平均生長速率分別為1.071,0.997, 0.316 mm/d。高濃度的Cd(NO3)2加速根尖細(xì)胞木質(zhì)化，Cd(NO3)2濃度越大，越不利于洋蔥根系生長。

表2為不同濃度Pb(NO3)2溶液中一周內(nèi)洋蔥根系的長度變化。由表2可知，整個培養(yǎng)期間，隨著Pb(NO3)2濃度的增大，洋蔥根系生長越緩慢，平均長度越小，與對照組相差不斷增大。當(dāng)Pb(NO3)2質(zhì)量濃度達(dá)到3000 mg/L時，培養(yǎng)1 d后與對照組相差3.692 mm，第2～7 d分別相差5.886, 8.191, 11.858, 16.970,21.422, 22.154 mm，時間越長根長差別越大。從組內(nèi)來看，當(dāng)Pb(NO3)2質(zhì)量濃度為1000, 2000, 3000 mg/L時，洋蔥根系平均生長速率分別為0.302, 0.167, 0.143 mm/d，其中3000 mg/L的Pb(NO3)2溶液中洋蔥根尖從第5 d起停止生長，這與高濃度Pb(NO3)2使洋蔥根系腐爛有關(guān)。

表2 不同濃度Pb(NO3)2中洋蔥根系長度Table 2 Root length of onion in different concentrations of Pb(NO3)2

2.1.3 洋蔥根系Logistics生長模型

利用Origin對不同溶液中洋蔥根系長度和生長時間進(jìn)行Logistics生長模型擬合，結(jié)果如圖2所示。

圖2 洋蔥根系生長狀況的Logistics方程擬合Fig. 2 Logistics equation fitting effect of onion root growth

由圖2可知，在Cd(NO3)2、Pb(NO3)2溶液中，洋蔥根系生長狀態(tài)均符合Logistics生長模型。Cd(NO3)2和Pb(NO3)2濃度越大，洋蔥根系平均長度越短。在60 mg/L Cd(NO3)2溶液中培養(yǎng)7 d后，洋蔥根系最短，平均長度為2.214 mm；在相同的培養(yǎng)時間內(nèi)，Pb(NO3)2質(zhì)量濃度為3000 mg/L時，洋蔥根系最短，平均長度為1.000 mm。洋蔥水培7 d后，根系長度基本穩(wěn)定，可作為實驗結(jié)果反映洋蔥根系生長情況。

表3為不同濃度Cd(NO3)2、Pb(NO3)2溶液中根系長度與生長時間Logistics方程擬合相關(guān)系數(shù)。

表3 不同溶液中Logistics方程擬合相關(guān)系數(shù)Table 3 Fitting correlation coefficient of Logistics equation in different concentrations of solution

由表3可知，在任何一種溶液中相關(guān)系數(shù)均大于0.99，符合相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，洋蔥根系生長均符合Logistics生長模型。

2.2 重金屬對洋蔥根尖有絲分裂的影響

2.2.1 鎘對洋蔥根尖有絲分裂的影響

為了深入研究不同重金屬的對洋蔥根系的影響，利用顯微鏡觀察在不同濃度Cd條件下洋蔥根系細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同濃度Cd(NO3)2溶液中洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂Fig. 3 Mitosis of onion root tip cells in different concentrations of Cd(NO3)2 solution

由圖3可知，對照組的洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂各個時期均正常；在20 mg/L Cd(NO3)2溶液中，細(xì)胞形態(tài)完好，染色均勻，此濃度下根尖細(xì)胞主要處于有絲分裂前期，細(xì)胞分裂不夠旺盛；在40 mg/L Cd(NO3)2溶液中，細(xì)胞核完好，根尖細(xì)胞主要處于分裂間期；在60 mg/L Cd(NO3)2溶液中，根尖細(xì)胞處于分裂間期，細(xì)胞核畸變，呈不規(guī)則形狀，同時出現(xiàn)細(xì)胞微核。

2.2.2 鉛對洋蔥根尖有絲分裂的影響

利用顯微鏡觀察在不同濃度Pb條件下洋蔥根系細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同濃度Pb(NO3)2溶液中洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂Fig. 4 Mitosis of onion root tip cells in different concentrations of Pb(NO3)2 solution

由圖4可知，在1000～2000 mg/L Pb(NO3)2溶液中培養(yǎng)7 d，部分洋蔥根尖細(xì)胞的細(xì)胞核畸變，呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀。在3000 mg/L Pb(NO3)2溶液中，洋蔥根尖細(xì)胞核由圓形或橢圓形變?yōu)榘朐卵罓?，根尖?xì)胞的細(xì)胞核、染色體等結(jié)構(gòu)受到破壞，培養(yǎng)后期根尖細(xì)胞停止生長甚至出現(xiàn)根系腐爛現(xiàn)象。這主要是因為Cd(NO3)2、Pb(NO3)2可抑制洋蔥根尖細(xì)胞紡錘體的形成，從而抑制根尖細(xì)胞的有絲分裂，導(dǎo)致根系生長速度減慢，甚至使根系細(xì)胞停止生長。

2.3 重金屬對洋蔥根尖過氧化物酶的影響

通過計算得出不同濃度Cd(NO3)2和Pb(NO3)2溶液中培養(yǎng)的洋蔥根系的POD酶活力，再以Cd(NO3)2、Pb(NO3)2質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，POD酶活力為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同濃度溶液中洋蔥根系POD酶活力Fig. 5 POD activity of onion roots in different concentrations of solution

由圖5a可知，當(dāng)Cd(NO3)2的質(zhì)量濃度在0～60 mg/L范圍內(nèi)時，POD酶活力與Cd(NO3)2濃度呈正相關(guān)，說明在此濃度范圍內(nèi)Cd(NO3)2對POD酶具有激活作用，也就是說此濃度范圍為Cd(NO3)2對洋蔥根尖細(xì)胞毒害所能承受的濃度范圍。當(dāng)Cd(NO3)2質(zhì)量濃度為60 mg/L，洋蔥根系的過氧化物酶活力最大，為28.0068 U。由圖5b可知，POD酶活力隨Pb(NO3)2濃度增大，呈現(xiàn)降低趨勢。當(dāng)Pb(NO3)2質(zhì)量濃度為3000 mg/L時，其POD酶活力最小，為0.8 U。高濃度的Pb(NO3)2對洋蔥根尖細(xì)胞POD酶活力有抑制作用，低濃度Cd(NO3)2溶液可激活POD活力。

2.4 重金屬對洋蔥根尖過氧化氫酶的影響

通過計算得出CAT酶活力，以Cd(NO3)2、Pb(NO3)2質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，POD酶活力為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同濃度溶液中洋蔥根系CAT酶活力Fig. 6 CAT activity of onion root in different concentrations of solution

由圖6a可知，當(dāng)Cd(NO3)2質(zhì)量濃度為20 mg/L時，洋蔥根尖細(xì)胞CAT酶活力較對照組的低；當(dāng)Cd(NO3)2質(zhì)量濃度為40 mg/L時，洋蔥根尖細(xì)胞CAT酶活力與對照組的相當(dāng)；當(dāng)Cd(NO3)2質(zhì)量濃度為60 mg/L時，洋蔥根尖細(xì)胞CAT酶活力高于對照組的，即高濃度的Cd(NO3)2對CAT酶具有激活作用。這是因為植物體具有對外界環(huán)境的應(yīng)激性，實驗中重金屬鎘可能抑制了洋蔥H2O2的分解或促進(jìn)了洋蔥產(chǎn)生H2O2，使得洋蔥根系細(xì)胞中積累了部分H2O2[26]，為分解過多的H2O2，從而使得CAT酶活力上升。由圖6b可知，在Pb(NO3)2脅迫下，各濃度CAT酶活力均低于對照組的，在Pb(NO3)2質(zhì)量濃度在1000～3000 mg/L范圍內(nèi)，CAT酶活力呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢。這是因為外界重金屬濃度升高會使洋蔥對其產(chǎn)出應(yīng)激反應(yīng)，促使CAT酶活力升高，但由于重金屬的毒性對酶造成的損害更大，酶活力雖有增加趨勢仍不能抵消重金屬的毒害作用，無法達(dá)到對照組的CAT酶活力。對比圖6a～b可知，Pb(NO3)2對CAT酶活力影響更明顯[27-28]。

3 結(jié)論

本研究通過模擬重金屬鉛、鎘污染環(huán)境，研究在Pb(NO3)2、Cd(NO3)2脅迫下洋蔥根尖形態(tài)、生長及根尖細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞POD和CAT酶活力等方面的變化，從形態(tài)和生理方面揭示了洋蔥根尖對重金屬Pb(NO3)2、Cd(NO3)2脅迫的響應(yīng)特征。研究發(fā)現(xiàn)，重金屬Pb(NO3)2、Cd(NO3)2對洋蔥根系的生長均具有抑制作用，可抑制根尖細(xì)胞的有絲分裂，使細(xì)胞停留在有絲分裂的前期或間期；抑制作用均隨著濃度的增大而增強。在一定濃度范圍內(nèi)Cd(NO3)2能激活洋蔥根尖細(xì)胞的過氧化物酶體系，促使洋蔥對重金屬Cd(NO3)2的脅迫呈現(xiàn)出積極的生理響應(yīng)特征。較高濃度的Pb(NO3)2、Cd(NO3)2溶液，使細(xì)胞無法進(jìn)行正常生命活動、停止生長甚至腐爛。本研究通過分析重金屬鉛、鎘對洋蔥根系長度、有絲分裂過程、酶活力等各項生理指標(biāo)的影響及其影響機制，為重金屬對植物生長機理的影響和重金屬污染土壤的生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)。