夏雙雙 陳 嵐 鄭 燁 王蓉佳 蔡 榮

1.上海理工大學(xué) 材料與化學(xué)學(xué)院 上海 200093

2.上海市食品藥品包裝材料測試所 檢測二室 上海 201203

1 研究背景

藥用橡膠制品具有熱穩(wěn)定性好、吸濕性弱、抗氧化性強、無生理毒性等特性。這些優(yōu)良特性與生產(chǎn)過程中所加助劑（潤滑劑、抗氧劑、硫化劑等）密不可分[1]。由于藥用橡膠制品配方的復(fù)雜性，其原材料及添加劑可能對藥物的有效成分或功能性輔料產(chǎn)生吸附作用，或過量的添加劑會遷移至包裝表面而進入藥液，從而影響藥品的質(zhì)量。如脂肪酸類潤滑劑作為藥用橡膠制品生產(chǎn)過程中常用的添加劑，具有一定浸出風(fēng)險，可能會影響藥物的安全性及有效性[2-3]。

國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《化學(xué)藥品注射劑生產(chǎn)所用的塑料組件系統(tǒng)相容性研究技術(shù)指南（試行）》中，明確要求對脂肪酸類化合物進行限量篩查。目前關(guān)于脂肪酸類化合物的測定方法有氣相色譜法[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-7]、高效液相色譜法[8-9]和傅里葉變換紅外光譜法[10]等。相比于其他檢測方法，氣相色譜法具有操作簡便、靈敏度較高、成本低等優(yōu)勢，是目前應(yīng)用較為廣泛的檢測方法。

對于藥品包裝中脂肪酸類化合物的檢測，目前文獻報道的僅有棕櫚酸和硬脂酸兩種[11]。根據(jù)動物試驗表明，脂肪酸類化合物中，油酸具有細(xì)胞毒性和蛋白酶抑制作用[12]。由于脂肪酸類化合物種類較多，實際藥品包裝材料可能同時含有多種脂肪酸類化合物，因此開發(fā)能夠同時檢測藥品包裝材料中多種脂肪酸的方法，具有重要意義。

本研究分別選用pH為2.5的緩沖液（簡稱pH2.5緩沖液）、pH為12.0的緩沖液（簡稱pH12.0緩沖液）、體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液（簡稱50%乙醇）作提取溶液，十七酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，采用氣相色譜-氫火焰離子（gas charomatography-flame ionization detector，GC-FID）法研究藥用橡膠制品中7種脂肪酸的提取情況，建立藥用橡膠制品中7種脂肪酸類化合物的快速、準(zhǔn)確檢測方法。

2 實驗

2.1 材料與試劑

肉豆蔻酸對照品，純度為99.0%，批號5150020；花生酸，純度為99.0%，批號59490020；反油酸對照品，純度為99.0%，批號A7670020；均購于上海安譜科學(xué)儀器有限公司。棕櫚酸對照品，純度為99.0%，批號190029-201603；硬脂酸對照品，純度為99.0%，批號190032-201603；油酸，純度為99.0%，批號111621-201506；均購于中國食品藥品檢定研究院。亞油酸對照品，純度為99.0%，批號U-59A-S9-A，購于ANPEL公司。十七酸甲酯對照品，純度為99.0%，批號KGVYE-PP，購于TCI公司。正己烷，色譜級，購于Merck公司。磷酸、氫氧化鈉、乙醇，分析純，均購于上?；瘜W(xué)試劑有限公司。三氟化硼甲醇溶液，購于ALDRICH公司。橡膠墊片、膠塞由企業(yè)提供，每種產(chǎn)品各3批。

2.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀，7890B，美國安捷倫科技有限公司；電子天平，XS205，梅特勒-托利多科技（中國）有限公司；電熱恒溫水浴鍋，HWS28，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；渦旋混合儀，XV-80A，上海滬西分析儀器廠有限公司。

2.3 色譜條件

色譜柱為 DB-23（Agilent 60 m×320 μm×0.25 μm）；進樣口溫度為270 ℃；載氣為高純度氮氣，流速為2.0 mL/min；進樣量為2.0 μL；升溫程序：130 ℃保持1 min，然后以10 ℃/ min的速率升至175 ℃，繼續(xù)以2.75 ℃/min的速率升至215 ℃，保持4 min。

2.4 溶液的配制

2.4.1 內(nèi)標(biāo)儲備溶液配制

精密稱取十七酸甲酯25 mg于25 mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。精密移取10 mL內(nèi)標(biāo)儲備液，置于500 mL容量瓶內(nèi)，用正己烷定容，得質(zhì)量濃度為20 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4.2 對照工作溶液配制

精密稱取肉豆蔻酸、硬脂酸、棕櫚酸、反油酸、油酸、亞油酸、花生酸各25 mg置于同一容量瓶（25 mL）中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，即得混合對照品儲備液。

精密量取對照品儲備液，使用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋，得對照物質(zhì)量濃度分別為1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0,100.0 μg/mL的混合對照溶液。

2.4.3 提取溶液配制

pH2.5緩沖液：量取磷酸8 mL，加入三乙胺14 mL，加水稀釋至1 500 mL，調(diào)節(jié)pH至2.5。pH12.0緩沖液：取氫氧化鈉配制成0.007 5 mol/L的溶液。50%乙醇溶液：取乙醇500 mL加水稀釋至1 000 mL。

2.4.4 測試溶液制備

精密量取2.4.2節(jié)中所配制的系列對照溶液各2 mL，分別加入1 mL三氟化硼甲醇溶液，加蓋密封，置于65 ℃烘箱中1 h。取出后，冷卻至室溫，加入飽和氯化鈉溶液5 mL，渦旋30 s后，放置分層，取上清液即為測試溶液[13]。

2.5 供試品溶液

將橡膠墊片、膠塞樣品中按比例（每1 g樣品2 mL提取液）加入3種提取介質(zhì)溶液，置于65 ℃烘箱中2.5 h后進行提取。精密量取10 mL提取溶液，置于具塞管中，滴加3滴體積分?jǐn)?shù)為4%的磷酸溶液，加入10 mL正己烷（含內(nèi)標(biāo)20 μg/mL），振搖1 min，靜置分層；取上層溶液2 mL，置于20mL頂空瓶中，加入1 mL二氯甲烷和1 mL三氟化硼甲醇溶液，加蓋密封，置于65 ℃烘箱中1 h；取出后，冷卻至室溫，加入飽和氯化鈉溶液5 mL，渦旋30 s后，放置分層，取上清液進樣。取3批不含目標(biāo)化合物的鹵化丁基膠塞，按上述同樣方法操作，所得溶液即為空白對照溶液。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜柱的選擇

考察HP-INNOWAX（Agilent 60 m×320 μm×0.50 μm）和 DB-23（Agilent 60 m×320 μm×0.25 μm）色譜柱對7種脂肪酸的分離效果。采用HPINNOWAX色譜柱實驗時，參考中國藥典2020版第四部，聚山梨酯80脂肪酸組成的色譜條件。結(jié)果表明，HP-INNOWAX色譜柱無法分離油酸與反油酸物質(zhì)，分離度較差，如圖1a中編號5為反油酸與油酸雙頭峰。而DB-23色譜柱能使反油酸與油酸完全分離，且所需分析時間也比HP-INNOWAX的短，如圖1b所示。因此實驗選擇DB-23色譜柱。

圖1 7種脂肪酸甲酯分離色譜圖Fig. 1 Chromatogram separation of 7 fatty acid methyl ester

3.2 前處理優(yōu)化

在樣品前處理中滴加磷酸，有利于將藥用橡膠制品中游離態(tài)脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿討B(tài)脂肪酸，可提高萃取效率。參考相關(guān)文獻和指導(dǎo)原則[14-16]，根據(jù)注射劑pH值范圍以及常見溶劑類型，本研究選擇pH2.5緩沖液、pH12.0緩沖液、50%乙醇溶液作為提取溶液，在比藥液要求更苛刻的條件下，研究藥用橡膠制品中7種脂肪酸的提取情況。實驗結(jié)果表明，對同一濃度的對照品，采用本研究方法進行甲酯化，測得的峰面積是中國藥典中方法的數(shù)倍，證明本方法脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率更高。并且選用烘箱，操作比回流法更簡單，有利于大批量處理樣品，甲酯化反應(yīng)更為充分。

3.3 系統(tǒng)適用性

選擇不含目標(biāo)化合物藥用橡膠制品為空白基底，3種提取液中分別添加7種目標(biāo)化合物，使各提取液中化合物質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL，按2.5節(jié)所述方法進行處理。取2.4.4節(jié)中質(zhì)量濃度為100 μg/mL的混合對照品測試液1 mL，按2.3節(jié)中色譜條件進樣分析，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，7種脂肪酸甲酯及內(nèi)標(biāo)峰均能較好地分離，分離度均大于1.7，理論塔板數(shù)均大于20 000，表明測試系統(tǒng)的適用性較好。

圖2 7種脂肪酸甲酯色譜圖Fig. 2 Chromatogram of 7 fatty acid methyl ester

3.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

取2.4.4節(jié)所得系列混合對照品測試液各1 mL，分別按照2.3節(jié)所述儀器條件進行測定分析。以各脂肪酸甲酯化的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)y，以各脂肪酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出擬合直線，結(jié)果見表1。由表1可知，各組分的質(zhì)量濃度為5.0～100.0 μg/mL時，y與x之間的線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999。

表1 線性、檢測下限和定量下限實驗結(jié)果Table 1 Results of linearity, LODs and LOQs

取線性最低濃度點對照品溶液逐級稀釋，精密量取稀釋后溶液2 mL，按照2.4.4節(jié)所述甲酯化，制備測試液，再按照儀器條件進行測定，分別以S/N=3和S/N=10對應(yīng)各待測物質(zhì)檢出限和定量限，結(jié)果見表1。由表1可知，7種脂肪酸的檢出限與定量限分別為1.0 μg/mL和2.0 μg/mL，表明該方法的靈敏度較高。

3.5 加標(biāo)回收率和精密度

選用不含上述7種脂肪酸的藥用彈性體密封件為空白樣品，3種提取液中分別添加7種目標(biāo)化合物，使各提取液中化合物質(zhì)量濃度分別達(dá)到10.0, 20.0,50.0 μg/mL，按照2.5節(jié)中的方法處理，平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果如表2所示。

表2 加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差實驗結(jié)果Table 2 The results of recoveries and RSD

由表2可知，7種脂肪酸在pH2.5緩沖液中的回收率為97.0%～100.6%，在pH12.0緩沖液中的回收率為97.3%～100.5%，在50%乙醇溶液中的回收率為97.3%～100.4%；3種提取介質(zhì)中所有對照物質(zhì)的RSD均不大于2.1%。這說明本研究所述方法的回收率良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗

將2.4.2節(jié)中配制的質(zhì)量濃度分別為10.0, 20.0,50.0 μg/mL的對照品溶液，于室溫下分別放置0, 4, 8,12, 24 h后，各取2 mL，按2.4.4所述方法甲酯化，制備測試液；再按2.3節(jié)中儀器色譜條件重復(fù)測定3次，計算RSD。結(jié)果表明，低中高3種質(zhì)量濃度的對照品溶液于室溫下放置24 h后，峰面積無明顯變化，7種脂肪酸的RSD分別為0.2%～0.6%、0.2%～0.8%、0.1%～2.6%、0.2%～1.1%、0.2%～0.7%、0.2%～1.3%、0.2%～5.0%。表明不同質(zhì)量濃度的對照品溶液穩(wěn)定性良好。

3.7 實際樣品分析

選用6批藥用橡膠樣品按照2.5節(jié)所述處理，制備3種不同樣品提取液后進樣測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算7種脂肪酸的質(zhì)量濃度。6批藥用橡膠制品只1批樣品在2種介質(zhì)中檢出棕櫚酸，結(jié)果如表3所示。

表3 某批橡膠樣品中脂肪酸提取試驗結(jié)果Table 3 A batch of rubber sample results of extraction test μg/g

表3的結(jié)果表明：只有一批藥用橡膠樣品，在pH12.0提取液和50%乙醇提取液下，檢測出了棕櫚酸，而在pH2.5提取液下沒檢測出來；其他幾種脂肪酸在此次測定中未檢出。

這些藥用橡膠樣品中除了其中一批含有棕櫚酸外，其余都未添加其他6種脂肪酸[11]?？赡茉蚴牵合噍^于其他脂肪酸，棕櫚酸具有無毒性及價格低等優(yōu)勢，而被廣泛用作合成橡膠的增塑劑和軟化劑；棕櫚酸在堿性條件下易皂化，在pH12.0提取液中容易從橡膠制品中遷移出來，且本身的化學(xué)性質(zhì)又使其容易被乙醇提取。

4 結(jié)論

本研究采用氣相色譜-氫火焰離子檢測器，建立藥用橡膠制品分別在pH2.5緩沖液、pH12.0緩沖液、50%乙醇3種提取液中所含脂肪酸類化合物的定量分析方法，并且通過實驗對所提方法進行評價，可得如下結(jié)論：

1）7種脂肪酸的甲酯化峰面積與其質(zhì)量濃度在5.0～100.0 μg/mL內(nèi)具有線性關(guān)系；7種脂肪酸的檢出限均為1.0 μg/mL；空白樣品加標(biāo)回收率為97.0%～100.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02%～2.1%。

2）本研究提出的方法優(yōu)化了色譜柱條件以及樣品處理等環(huán)節(jié)，其前處理簡單、準(zhǔn)確度好、精密度高，適合于藥用橡膠制品中脂肪酸類化合物含量的測定。

3）實際藥用橡膠樣品測定結(jié)果表明，樣品中存在少量棕櫚酸。當(dāng)藥液為酸性溶液時，棕櫚酸遷移的風(fēng)險較??；當(dāng)藥液為堿性溶液或者乙醇溶液時，可能會有一定量棕櫚酸遷移至藥液中，對用藥帶來一定的安全風(fēng)險，需結(jié)合藥液每天用量進行安全性評估。樣品中未檢出其他脂肪酸，但仍需關(guān)注。