黃彬，張軍，鄭金旭△，丁慢玲，吳妍

特發(fā)性肺纖維化（IPF）為一類病因未明的慢性進(jìn)展性纖維化性間質(zhì)性肺病，以肺泡上皮細(xì)胞損傷的異常修復(fù)、纖維細(xì)胞激活等共同導(dǎo)致的胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積為特征［1-2］。IPF 好發(fā)于中老年人，且發(fā)病率逐年上升［3］。盡管目前對IPF 病理方面的研究已取得較大突破，但對成纖維細(xì)胞在纖維組織重塑過程中激活的機(jī)制卻了解甚少。環(huán)狀RNA（circRNA）為一類3'至5'端反向剪接產(chǎn)生的單鏈閉合環(huán)狀RNA［4］。circRNA 可作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）競爭微小RNA（miRNA）結(jié)合位點(diǎn)，影響miRNA活性并減輕miRNA對靶mRNA的抑制；部分circRNA 結(jié)合蛋白后將其定位至特定DNA 序列，并充當(dāng)?shù)鞍字Ъ芊肿踊虻鞍缀＞d［5-6］。Li 等［7］從數(shù)據(jù)集GSE102660中發(fā)現(xiàn)IPF樣本中存在67個(gè)表達(dá)失調(diào)的circRNA，其中circ_0007762明顯上調(diào)。本研究在預(yù)測circ_0007762 的靶miRNA 的基礎(chǔ)上，探討circ_0007762能否通過ceRNA 機(jī)制調(diào)節(jié)自噬這一亞細(xì)胞降解途徑，影響肺成纖維細(xì)胞增殖分化，進(jìn)而調(diào)控IPF進(jìn)程并促進(jìn)纖維化樣表型，為探索IPF進(jìn)展的潛在機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚肺成纖維細(xì)胞株HFL1、F12K 培養(yǎng)基，青霉素-鏈霉素（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清（Gibco 公司）；轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）購自Sigma公司；circ_0007762 小干擾RNA（si-circ_0007762）由廣州銳博生物科技有限公司合成；miRNA inhibitor 及mimics 由北京合生生物科技有限公司合成；TransMaxR-100（bioexplorer 公司）；反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（TAKARA 公司）；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、CCK-8、BCA試劑盒及ECL發(fā)光液（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；PARISTM核質(zhì)分離試劑盒（賽默飛公司）；HEK293細(xì)胞株、circ_0007762引物、雙熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建（廣州吉賽生物科技有限公司）；其他引物（上海生工股份有限公司）；TRIzol、Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司）；兔抗GAPDH、Ⅰ型膠原（collagenⅠ）抗體（proteintech公司）；兔抗P62、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β（LC3B）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 通過GEO 數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）分 析circ_0007762 在IPF 患 者circRNA 數(shù) 據(jù) 集GSE102660 中的表達(dá)。使用circBank 數(shù)據(jù)庫（www.circbank.cn）獲取circ_0007762 基本信息。通過ENCORI（starbase.sysu.edu.cn）及circBank 預(yù)測circ_0007762 的靶miRNA 及相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，并與GEO 來源的IPF 肺組織miRNA 表達(dá)譜GSE13316取交集篩選靶miRNA。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及給藥分組 HFL1細(xì)胞接種于F12K培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素，于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。通過轉(zhuǎn)染si-circ_0007762 實(shí)現(xiàn)circ_0007762 敲低，通過轉(zhuǎn)染miR-18a-5p 模擬物和抑制劑實(shí)現(xiàn)miR-18a-5p 的過表達(dá)和敲低。接種HFL1 細(xì)胞于6 孔板，待其生長至60%～70%融合度時(shí)，依照TransMaxR-100 說明書轉(zhuǎn)染si-circ_0007762、miRNA模擬物、抑制劑及相應(yīng)陰性對照（終濃度50 nmol/L），轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染序列見表1。轉(zhuǎn)染后添加TGF-β1（10μg/L）、二甲基亞砜（DMSO，0.1%）或3-MA（5 nmol/L，溶于0.1%DMSO）干預(yù)48 h。實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）正常組（Control組）、TGF-β1組、TGF-β1+DMSO組、TGF-β 1+3-MA 組。（2）si-NC 組（siRNA 陰性對照）、si-circ_0007762組（轉(zhuǎn)染si-circ_0007762）、miR-NC組（轉(zhuǎn)染miRNA單鏈陰性對照）、miR-18a-5p inhibitor 組（轉(zhuǎn)染miR-18a-5p inhibitor）、mimics-NC 組（轉(zhuǎn)染miRNA 雙鏈陰性對照）、miR-18a-5p mimics 組（轉(zhuǎn)染miR-18a-5p mimics）、si-circ_0007762+miRNC組、si-circ_0007762+miR-18a-5p inhibitor組。

Tab.1 Synthetic gene sequences表1 合成物基因序列

1.2.3 Sanger測序及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 委托廣州吉賽生物科技有限公司利用sanger 測序檢測環(huán)化位點(diǎn)，驗(yàn)證circ_0007762 引物特異性。TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA 后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，檢測給藥或轉(zhuǎn)染后的circ_0007762表達(dá)改變，以U6 為內(nèi)參檢測miR-18a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p水平變化，各引物序列見表2。實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）Control 組、TGF-β1 組。（2）si-NC 組、si-circ_0007762 組。（3）miR-NC 組、miR-18a-5p inhibitor 組。（4）mimics-NC 組、miR-18a-5p mimics組。

1.2.4 熒光原位雜交（FISH）及核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn) HFL1細(xì)胞爬片由4%多聚甲醛固定5 min，0.5%Triton X-100 于室溫孵育后無水乙醇洗滌。Cy3 標(biāo)記的circ_0007762 探針變性：88 ℃5 min，4 ℃3 min。加入探針雜交，37 ℃孵育過夜。第2天棄雜交液后2×含鹽的檸檬酸鈉緩沖液（SSC）漂洗爬片。50μL DAPI-Antifade 溶液滴于載玻片，將爬片倒扣在液滴上并封片，避光20 min 以上，通過激光共聚焦顯微鏡觀察。利用PARISTM試劑盒分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白及RNA，分別對2種RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

Tab.2 Primer sequences for qPCR表2 qPCR引物序列

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 通過PCR 分別擴(kuò)增包括miR-18a-5p結(jié)合位點(diǎn)的circ_0007762 3'UTR序列，將目的片段連接入psiCHECK2 載體中，得到野生型circ_0007762 3'UTR 報(bào)告基因載體circ_0007762 WT。上述序列突變并擴(kuò)增后連接入psiCHECK2 載體，得到突變型載體circ_0007762 MUT。參照說明書使用Lipofectamine 2000 共轉(zhuǎn)染1μg 報(bào)告基因載體與終濃度100 nmol/L 的miR-18a-5p mimics 或mimics-NC 至HEK293 細(xì)胞中。48 h 后收取細(xì)胞，用發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。

1.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將HFL1細(xì)胞（約3×103/孔）接種至96孔板，在37 ℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）si-NC 組、si-circ_0007762 組、si-circ_0007762+miR-NC 組、sicirc_0007762+miR-18a-5p inhibitor組。（2）Control組、TGF-β1組、TGF-β1+DMSO組、TGF-β1+3-MA組。分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h 添加CCK-8 試劑10μL/孔，37 ℃孵育1 h 后測量450 nm 處的光密度，計(jì)算各組間細(xì)胞活力。細(xì)胞活力＝（給藥組光密度-空白組光密度）/（正常組光密度-空白組光密度）×100%。

1.2.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）Control 組、TGF-β1組、TGF-β1+si-NC 組、TGF-β1+si-circ_0007762 組、TGF-β 1+si-circ_0007762+miR-NC 組、TGF-β1+si-circ_0007762+miR-18a-5p inhibitor 組。（2）TGF-β1 組、TGF-β1+DMSO 組、TGF-β1+3-MA組。提取各組HFL1總蛋白，BCA法定量后蛋白變性。取30μg進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，4 ℃兔抗一抗孵育過夜：GAPDH 抗體（1∶5 000）；collagenⅠ抗體（1∶3 000）；P62、LC3B、α-SMA抗體（1∶1 000）。HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，暗室內(nèi)使用ECL 發(fā)光液顯影曝光及Image J軟件分析上述蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graphpad Prism 8.3.0 及SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0007762 的miRNA 靶標(biāo)的預(yù)測及篩選結(jié)果 通過對GEO 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集GSE102660 分析發(fā)現(xiàn)，circ_0007762在IPF中上調(diào)，見圖1A。circBank查詢結(jié)果提示circ_0007762定位于6號染色體q24.3片段（147581750-147599340），由外顯子反向剪接形成，見圖1B。利用circBank 及ENCORI 分別預(yù)測出25個(gè)和17個(gè)circ_0007762的miRNA靶點(diǎn)，將兩者與GEO 數(shù)據(jù)集GSE13316 中504 個(gè)下調(diào)的miRNA 取交集，初步篩選出circ_0007762可能的靶miRNA：miR-18a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p，見圖1C。

Fig.1 The circ_0007762 pattern and the screening of its target miRNAs圖1 circ_0007762模式圖及其靶miRNA篩選

2.2 TGF-β1 干預(yù)后HFL1 細(xì)胞中circ_0007762 及miRNA 表達(dá)變化 Sanger 測序示circ_0007762 的PCR 產(chǎn)物環(huán)化位點(diǎn)（圖2A）。與Control 組相比，在TGF-β1干預(yù)HFL1 48 h后，circ_0007762、miR-135a-5p 和miR-135b-5p 表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），miR-18a-5p表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見圖2B、C。miR-18a-5p與circ_0007762存在競爭性結(jié)合的可能性更大。

2.3 circ_0007762 競爭性結(jié)合miR-18a-5p 熒光原位雜交及核質(zhì)分離結(jié)果顯示circ_0007762細(xì)胞質(zhì)分布多于細(xì)胞核，見圖3。利用ENCORI數(shù)據(jù)庫證實(shí)circ_0007762 存在miR-18a-5p 結(jié)合位點(diǎn)，見圖4A；熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在circ_0007762 WT 中，與mimics-NC 組相比，miR-18a-5p mimics 組熒光素酶活性明顯減弱（P＜0.05），見圖4B，證明兩者存在內(nèi)源性結(jié)合。此外，抑制circ_0007762 表達(dá)后可上調(diào)miR-18a-5p 表達(dá)水平（P＜0.05），見圖5A。抑制miR-18a-5p 表達(dá)可上調(diào)circ_0007762 表達(dá)水平，增強(qiáng)miR-18a-5p 表達(dá)則下調(diào)circ_0007762 表達(dá)水平（P＜0.05），見圖5B、C。

2.4 敲低circ_0007762 對細(xì)胞增殖的抑制作用及miR-18a-5p 對其影響 CCK-8 結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-circ_0007762組HFL1細(xì)胞增殖活性受到抑制（P＜0.05），然而si-circ_0007762+miR-18a-5p inhibitor 組 與si-circ_0007762+miR-NC 組 相 比，HFL1 增殖活性升高（P＜0.05），敲低miR-18a-5p 的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了si-circ_0007762 對HFL1 細(xì)胞的增殖抑制作用，見圖6、表3。

Fig.2 The cyclization site of circ_0007762 and changes of circ_0007762 and miRNAs after TGF-β1 intervention圖2 circ_0007762環(huán)化位點(diǎn)及TGF-β1干預(yù)后HFL1細(xì)胞中circ_0007762及miRNA表達(dá)變化

Fig.3 Subcellular localization of circ_0007762圖3 circ_0007762亞細(xì)胞定位

2.5 敲低circ_0007762抑制肺成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)表型并激活自噬的作用及抑制miR-18a-5p 對其影響 Western blot 結(jié)果顯示，在HFL1 細(xì)胞中，與Control組相比，TGF-β1干預(yù)后α-SMA、collagenⅠ表達(dá)升高；相反，siRNA 敲低circ_0007762 表達(dá)后α-SMA、collagenⅠ表達(dá)下降，纖維化受到抑制，并且其對α-SMA、collagenⅠ表達(dá)的影響可被miR-18a-5p的抑制所逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），見圖7、表4。相較于Control組，TGF-β1干預(yù)后P62表達(dá)降低，同時(shí)LC3BⅡ/Ⅰ升高，自噬活化；相反，siRNA 敲低circ_0007762 表達(dá)后P62 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)LC3BⅡ/Ⅰ降低，自噬被抑制；并且si-circ_000776 對P62 及LC3BⅡ/Ⅰ表達(dá)的影響可因miR-18a-5p 的抑制所逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），見圖7、表4。

Fig.4 Binding sites of circ_0007762 to miR-18a-5p and results of dual-luciferase assay圖4 circ_0007762與miR-18a-5p的結(jié)合位點(diǎn)及雙熒光素酶檢測結(jié)果

Fig.5 The interaction between circ_0007762 and miR-18a-5p圖5 circ_0007762與miR-18a-5p的相互作用關(guān)系

Fig.6 Effects of circ_0007762 and miR-18a-5p inhibition on HFL1 proliferation圖6 抑制circ_0007762及miR-18a-5p表達(dá)對HFL1增殖的影響

Tab.3 Comparison of HFL1 cell viability between the four groups表3 各組間HFL1細(xì)胞活力差異（n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of HFL1 cell viability between the four groups表3 各組間HFL1細(xì)胞活力差異（n=3，%，±s）

**P＜0.01，a 與si-NC 組比較，b 與si-circ_0007762+miR-NC 組比較，P＜0.05。

組別si-NC組si-circ_0007762組si-circ_0007762+miR-NC組si-circ_0007762+miR-18a-5p inhibitor組F 24 h 129±6 105±14a 89±8 121±14b 7.672**48 h 229±31 184±23 165±26 194±24 3.151 72 h 393±31 318±17a 256±27 355±28b 14.761**

Fig.7 Effects of circ_0007762 and miR-18a-5p inhibition on protein expression in HFL1 cells圖7 抑制circ_0007762及miR-18a-5p表達(dá)對HFL1細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

2.6 自噬抑制劑3-MA緩解了肺成纖維細(xì)胞增殖及纖維化表型 TGF-β1 加速了HFL1 細(xì)胞的增殖，而與TGF-β1+DMSO 組比較，3-MA 的 干預(yù)抑制了HFL1 細(xì)胞的增殖（P＜0.05），見圖8、表5。此外，TGF-β1+3-MA 組較TGF-β1+DMSO 組collagenⅠ、α-SMA 表達(dá)下調(diào)，LC3BⅡ/Ⅰ下降，而P62 表達(dá)上調(diào)，通過抑制細(xì)胞自噬緩解了纖維化（P＜0.05），見圖9、表6。

Tab.4 Comparison of autophagy and fibrosis related protein expression between the six groups表4 各組自噬及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of autophagy and fibrosis related protein expression between the six groups表4 各組自噬及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 （n=3，±s）

**P＜0.01；a與Control組比較，b與TGF-β1+si-NC組比較，c與TGF-β1+si-circ_0007762+miR-NC組比較，P＜0.05。

組別Control組TGF-β1組TGF-β1+si-NC組TGF-β1+si-circ_0007762組TGF-β1+si-circ_0007762+miR-NC組TGF-β1+si-circ_0007762+miR-18a-5p inhibitor組F α-SMA 1.00±0.02 2.46±0.21a 2.06±0.13 1.13±0.13b 1.04±0.15 1.96±0.11c 60.794**collagen Ⅰ1.00±0.00 2.31±0.20a 1.94±0.10 1.09±0.06b 1.36±0.15 2.63±0.09c 94.044**P62 1.00±0.01 0.47±0.07a 0.42±0.06 0.89±0.06b 0.81±0.13 0.40±0.11c 30.874**LC3BⅡ/Ⅰ1.00±0.03 2.80±0.17a 2.65±0.16 1.43±0.07b 1.68±0.41 3.88±0.34c 59.812**

Fig.8 Effects of 3-MA on HFL1 proliferation induced by TGF-β1圖8 3-MA對TGF-β1誘導(dǎo)的HFL1增殖的影響

Tab.5 Differences in HFL1 cell viability between the four groups表5 各組間HFL1細(xì)胞活力差異（n=3，%，±s）

Tab.5 Differences in HFL1 cell viability between the four groups表5 各組間HFL1細(xì)胞活力差異（n=3，%，±s）

**P＜0.01；a與Control組比較，b與TGF-β1+DMSO組比較，P＜0.05。

組別Control組TGF-β1組TGF-β1+DMSO組TGF-β1+3-MA組F 72 h 372±27 486±52a 466±35 297±44b 14.003**24 h 133±7 156±17 171±7 112±18b 11.450**48 h 238±24 273±24 269±9 189±14b 12.515**

Fig.9 Effects of 3-MA on protein expression induced by TGF-β1 in HFL1 cells圖9 3-MA對TGF-β1誘導(dǎo)的HFL1細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

Tab.6 Comparison of autophagy and fibrosis related protein expression between the three groups表6 各組自噬及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.6 Comparison of autophagy and fibrosis related protein expression between the three groups表6 各組自噬及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

**P＜0.01；a與TGF-β1組比較，b與TGF-β1+DMSO組比較，P＜0.05。

組別TGF-β1組TGF-β1+DMSO組TGF-β1+3-MA組F α-SMA 1.00±0.01 0.89±0.16 0.35±0.06ab 37.295**collagen Ⅰ1.00±0.04 1.02±0.05 0.57±0.05ab 85.386**P62 1.00±0.08 1.00±0.09 1.66±0.26ab 15.614**LC3BⅡ/Ⅰ1.00±0.02 1.06±0.07 0.60±0.13ab 26.530**

3 討論

circRNA 與miRNA 的結(jié)合對IPF 進(jìn)展起關(guān)鍵作用，近年多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)該機(jī)制涉及IPF 中肺成纖維細(xì)胞功能異常。Zhang 等［8］發(fā)現(xiàn)circ_0044226 可充當(dāng)miR-7的ceRNA，增強(qiáng)人胚肺細(xì)胞WI38細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。而circTADA2A作為miR-526b或miR-203 的ceRNA 可調(diào)控小窩蛋白1/2 的表達(dá)，抑制肺成纖維細(xì)胞的激活，減輕ECM 沉積并緩解IPF 進(jìn)程［9］。Zhang 等［10］發(fā)現(xiàn)miR-18a-5p 在纖維化小鼠及胸膜間皮細(xì)胞中表達(dá)降低，并靶向抑制TGFβ 受體2 緩解類上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-18a-5p 在TGF-β1 誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞中降低，可能是IPF 中重要的保護(hù)性因子。并且抑制circ_0007762可促進(jìn)miR-18a-5p表達(dá)，而抑制miR-18a-5p 同樣可上調(diào)circ_0007762 表達(dá)，兩者呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了兩者的內(nèi)源性結(jié)合。由此可見，circ_0007762 可充當(dāng)miR-18a-5p 的ceRNA，通過負(fù)調(diào)控miR-18a-5p，作為重要的促纖維化因子，誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞發(fā)生纖維化表型。

肺成纖維細(xì)胞對損傷修復(fù)至關(guān)重要，其異常激活對IPF進(jìn)展最為關(guān)鍵［11］。肺成纖維細(xì)胞受促纖維化介質(zhì)誘導(dǎo)而異常活化增殖，增強(qiáng)ECM 分泌，后者加速肌成纖維細(xì)胞分化（FMT）及ECM 合成的前饋循環(huán)，使肺纖維化程度持續(xù)加?。?2］。TGF-β1是IPF中最強(qiáng)的促纖維化因子，以往有報(bào)道其對肺泡上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增殖存在調(diào)控作用，可抑制肺泡上皮細(xì)胞增殖而促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖［13-14］。本實(shí)驗(yàn)表明circ_0007762可促進(jìn)HFL1細(xì)胞的活化與增殖，且該作用可被miR-18a-5p 所逆轉(zhuǎn)，提示circ_0007762對細(xì)胞增殖調(diào)控部分是通過miR-18a-5p變化而實(shí)現(xiàn)的。

自噬是選擇或非選擇性對胞質(zhì)物質(zhì)進(jìn)行降解的適應(yīng)性過程，以巨噬、微噬和伴侶介導(dǎo)的自噬為主要的3 種類型［15-16］。大量證據(jù)揭示自噬參與IPF 的發(fā)病環(huán)節(jié)，但目前對兩者的關(guān)系尚且存在爭議。Hill等［17］認(rèn)為在IPF 肺組織中自噬受損，抑制自噬可通過NF-κB/Snail2 通路促進(jìn)類上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。然而，另有研究發(fā)現(xiàn)自噬正向調(diào)控TGF-β1 誘導(dǎo)的細(xì)胞纖維化過程；首先，自噬有助于肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡抵抗，這是肺纖維化發(fā)展所必需的［18］，其次，TGFβ1誘導(dǎo)IPF和非IPF肺成纖維細(xì)胞中collagenⅠ及纖連蛋白的生成，同時(shí)促進(jìn)自噬體的積累，激活自噬通量［19］。此外，有報(bào)道阿奇霉素顯著減少了TGF-β干預(yù)后的成纖維細(xì)胞膠原分泌，治療過程伴隨著溶酶體功能受損［20］。本研究證實(shí)TGF-β1 可激活自噬，并伴隨膠原產(chǎn)生增強(qiáng)及α-SMA 這一肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物升高，表明自噬可能參與肺纖維化早期的啟動環(huán)節(jié)。此外，在circ_0007762 抑制后自噬受到抑制，HFL1 的FMT 改變得到改善，膠原分泌減少。而抑制circ_0007762 后上述受損過程同樣可由miR-18a-5p 下調(diào)有所恢復(fù)，這揭示circ_0007762 參與自噬的活化，能激活肺成纖維細(xì)胞增殖，抵抗FMT 變化，并且該過程一定程度上受miR-18a-5p影響?？傮w來看，自噬在IPF肺組織與TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化模型的差異性可能由兩者所處病程的不同來解釋，細(xì)胞模型更趨于纖維化早期發(fā)展，而IPF 肺組織樣本則呈現(xiàn)纖維化終末期變化，其中可能存在微環(huán)境的適應(yīng)過程。非IPF 來源的肺成纖維細(xì)胞對collagenⅠ敏感，在應(yīng)激時(shí)凋亡增加，而IPF成纖維細(xì)胞因長期暴露于該微環(huán)境導(dǎo)致對collagenⅠ脫敏［21］。此外，自噬還參與細(xì)胞增殖的調(diào)控，有研究發(fā)現(xiàn)3-MA可抑制骨分化和增殖，自噬激活劑雷帕霉素則可增強(qiáng)成骨分化和增殖［22］。同時(shí)自噬介導(dǎo)了接觸抑制所致的增殖減少［23］。本研究中，在使用3-MA 阻斷自噬通量后，HFL1 增殖活性受抑制，這揭示了自噬可以促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的活化增殖。

綜上所述，本研究證明circ_0007762 可作為miR-18a-5p的ceRNA，通過激活自噬活化肺成纖維細(xì)胞增殖，加速FMT，誘導(dǎo)纖維化表型，為理解circ_0007762 介導(dǎo)的肺纖維化機(jī)制提供了新的信息。然而，本研究僅通過體外驗(yàn)證circ_0007762 及miR-18a-5p 對肺成纖維細(xì)胞的影響，IPF 的病變過程涉及多細(xì)胞功能失調(diào)，除成纖維細(xì)胞外，還累及肺泡上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等。此外，circ_0007762 改變在體內(nèi)的效應(yīng)可能不同于體外，這需要進(jìn)一步研究。