何 威，孫宏利，黃惠梅，李清紅

(1.西安市兒童醫(yī)院 陜西省兒科疾病研究所 陜西省兒童疾病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點實驗室，陜西 西安 710003；2.西安市兒童醫(yī)院腎臟內(nèi)科，陜西 西安710003；3.西北婦女兒童醫(yī)院新生兒科，陜西 西安 710061)

抑郁癥是一種常見的慢性精神類疾病，影響思維、情緒和身體健康，主要表現(xiàn)為情緒低落、缺乏活力、悲傷、睡眠障礙及生活質(zhì)量差[1]。迄今為止抑郁癥缺乏滿意的治療方案。研究表明，胎兒對應(yīng)激異常敏感，懷孕期間暴露于不良事件、自然災(zāi)害及母親的抑郁癥狀會增加子代出現(xiàn)情緒、行為和/或認(rèn)知問題的風(fēng)險[2]，這種影響可能延續(xù)至整個成年期[3]。目前關(guān)于產(chǎn)前應(yīng)激(prenatal stress，PS)如何增加子代抑郁樣行為易感性的機制研究較少。

海馬是抑郁癥患者大腦中備受關(guān)注的區(qū)域之一。海馬通過抑制下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸活動，廣泛地參與大腦認(rèn)知和情感處理過程，從而在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Meta分析顯示，成年抑郁癥患者海馬的體積減少約5%[4]。PS與子代海馬的功能和微觀結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，胎兒期的海馬發(fā)育較易受到PS的影響[5]。海馬的結(jié)構(gòu)及分子改變可能在抑郁癥的病理學(xué)機制中扮演重要的角色。本研究結(jié)合磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究PS誘導(dǎo)抑郁樣子代大鼠大腦海馬的蛋白質(zhì)磷酸化和代謝的改變及生物相關(guān)性，為精神系統(tǒng)疾病與環(huán)境因素、遺傳因素之間建立了新的機制聯(lián)系，為臨床抑郁癥的治療或輔助治療提供新的見解。

1 資料與方法

1.1 產(chǎn)前慢性束縛應(yīng)激動物模型的建立及實驗分組

本實驗采用Sprague-Dawley大鼠，體重約為230～300g，置于22℃及12h的暗/光循環(huán)環(huán)境中，自由攝食飲水。所有實驗均獲得西安交通大學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)。

將雌性和雄性大鼠于晚上20:00～22:00以3∶1比例交配。次日早晨7:00～8:00對雌性大鼠進行陰道涂片檢查，若精子呈陽性被記為妊娠第0d并單籠飼養(yǎng)。懷孕母鼠被隨機分為對照組(n=8)和PS組(n=8)。慢性束縛應(yīng)激模型建立參考課題組已發(fā)表文獻[6]。分娩后，從每窩隨機選擇1～2只雄性子鼠用于后續(xù)實驗。

1.2 行為學(xué)實驗

1.2.1糖水偏好實驗(sucrose preference test，SPT)

隨機選取45只1月齡雄性子鼠進行SPT，用于對子代大鼠PS易感性的評估。實驗前，在大鼠籠中放置1%蔗糖水進行24h的適應(yīng)性練習(xí)。禁水禁食24h后，于次日早晨8:00～9:00進行SPT。向大鼠隨機提供1瓶飲用水和1瓶1%蔗糖水溶液(容量相當(dāng))。1h后，分別測量糖水和飲用水?dāng)z入量，計算公式為蔗糖偏好百分比=糖水消耗量/(糖水消耗量+飲用水消耗量)×100%。與對照組相比蔗糖偏好百分比下降30%以上的雄性大鼠判定為PS-S(PS-Susceptibility)子代大鼠。

1.2.2 其他行為學(xué)實驗

SPT完成后，隨機選取PS-S組和CON組(對照組)各8只進行曠場實驗(open field test，OFT)、強迫游泳實驗(forced swim test，F(xiàn)ST)、懸尾實驗(tail suspension test，TST)并記錄實驗結(jié)果。上述行為學(xué)實驗完成后，將大鼠麻醉。冰上取出全腦，快速從大腦中分離出海馬組織，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛋白質(zhì)組質(zhì)譜采集

使用組織裂解液提取海馬組織總蛋白，二喹啉甲酸蛋白檢測法測定蛋白質(zhì)濃度。取適量蛋白質(zhì)用胰蛋白酶消化后使用C18 Cartridge對酶解肽段進行脫鹽、去除高尿素，真空離心干燥后在40μL溶解緩沖液中復(fù)溶。根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tags，TMT)標(biāo)記試劑盒說明，每個樣品各取100μg肽段用于TMT標(biāo)記。將標(biāo)記后的混合肽段溶液真空凍干，然后用磷酸化肽段富集試劑盒富集，濃縮的磷酸肽溶液凍干并復(fù)溶在20μL 0.1%甲酸溶液中，用于液相串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。

樣品用液相系統(tǒng)進行鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)分析。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為84%乙腈-0.1%甲酸水溶液。色譜柱以95% A預(yù)平衡30min，將磷酸肽轉(zhuǎn)移到nanoViper C18色譜柱上，流速為300nL/min。經(jīng)過C18-A2分析柱分離后，用Q-Exactive型質(zhì)譜儀對肽樣進行檢測。使用MaxQuant軟件提取并分析原始數(shù)據(jù)。根據(jù)倍數(shù)變化大于1.2或小于0.83和P<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)，確定差異表達磷酸化肽段。

1.4 非靶向代謝組質(zhì)譜采集

每個樣品取5mg海馬勻漿懸浮在800μL預(yù)冷的甲醇：乙腈溶液(1∶1，v/v)中。渦旋后，超聲30min，重復(fù)兩次。-20℃ 放置60min，14 000r/min 4℃離心15min。

將上清液注入Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)。流動相組成A：水+25mmol/L乙酸銨+25mmol/L氨水，B：乙腈。梯度洗脫程序：0～1min，95% B；1～14min，線性降至65% B；14～16min，線性降至40% B；16～18min，維持在40% B；18～18.1min，線性升至95% B；18.1～23min，維持在95% B。將分離的代謝產(chǎn)物使用AB Triple TOF 5600質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析，分別以電噴霧離子源正離子和負(fù)離子模式檢測。

使用ProteoWizardConver軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzML格式，然后使用XCMS程序校準(zhǔn)保留時間、提取峰面積、標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。通過精確質(zhì)量數(shù)(m/z tolerance±30ppm,RT tolerance±60s)、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與實驗室自建數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)雙重匹配的方式鑒定代謝產(chǎn)物種類。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PS-S大鼠的行為學(xué)評估

采用SPT將PS易感性子代大鼠設(shè)定為PS-S組(38.78%)。與對照組相比，PS-S子代大鼠在OFT的穿越總格數(shù)、中心格數(shù)、直立次數(shù)和在中央格內(nèi)的停留時間顯著減少(t值分別為14.70、6.396、9.058、14.27，P<0.05)，在FST和TST中的不動時間顯著延長(t值分別為17.70、8.751，P<0.05)。這些結(jié)果證實了PS模型和SPT篩選條件的有效性。

2.2 PS對PS-S大鼠大腦海馬磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的影響

研究使用TMT技術(shù)標(biāo)記肽段、固相金屬親和色譜技術(shù)分離富集磷酸化多肽，隨后采用高分辨液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜收集PS-S大鼠的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，分別檢測并量化了2 978個磷酸化蛋白質(zhì)，6 790個磷酸化肽段，9 817個磷酸化位點。與對照組相比，篩選出197個(6%)差異表達的磷酸化肽段(其中140個豐度升高，57個豐度下降)，見表1。同時研究采用超高效液相色譜系統(tǒng)分離代謝產(chǎn)物，并使用Triple-TOF質(zhì)譜儀檢測上述樣本獲得非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，在ESI正離子和負(fù)離子模式下分別檢測到8 622和11 119個離子峰。分析正負(fù)離子峰共有80個差異代謝產(chǎn)物出現(xiàn)相對豐度的顯著變化(其中55個升高，25個下降)，見表1。

表1 差異磷酸化肽段/代謝產(chǎn)物結(jié)果統(tǒng)計表Table 1 Statistics of deferential phosphor-peptides/metabolites

2.3 KEGG代謝通路注釋比較及富集分析

本研究對差異表達磷酸化肽段與代謝產(chǎn)物所屬的KEGG通路進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)差異分子共同參與44條代謝通路，以韋恩圖形式展示，見圖1A。將KEGG通路中同時被注釋到差異分子數(shù)量最多的前10個KEGG通路界定為主要的共有通路，條目名稱和被注釋到的差異分子數(shù)量以柱狀圖形式展示，見圖1B。結(jié)果顯示兩個組學(xué)的差異分子共同富集的KEGG通路主要包括膽堿能突觸、長時程增強、晝夜夾帶、甘油磷脂代謝、內(nèi)源性大麻素信號、促性腺激素釋放激素信號通路、催產(chǎn)素信號通路和醛固酮的合成及分泌信號通路，這些主要共有通路可能參與了PS導(dǎo)致子代抑郁樣行為的生物學(xué)機制。

2.4 組學(xué)數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

本研究構(gòu)建了基于Pearson相關(guān)系數(shù)的矩陣熱圖，根據(jù)其表達特征可以將差異磷酸化肽段分成兩組，組內(nèi)彼此呈正相關(guān)關(guān)系，組間彼此呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，見圖2。

注：A差異磷酸化肽段(藍色)和差異代謝產(chǎn)物(黃色)參與通路的韋恩圖；B包含差異磷酸化肽段(藍色)和代謝產(chǎn)物(橘色)數(shù)量最多的前10個KEGG通路柱狀圖。圖1 多組學(xué)數(shù)據(jù)KEGG通路可視化分析圖Fig.1 KEGG pathway visualization analysis of multi-omics data

注：橫坐標(biāo)和左側(cè)縱坐標(biāo)均代表顯著差異修飾肽段及代謝產(chǎn)物。右側(cè)縱坐標(biāo)是Pearson相關(guān)系數(shù)r，r>0表示正相關(guān)(紅色)，r<0表示負(fù)相關(guān)(藍色)；顏色越深表示相關(guān)性越強。圖2 顯著差異磷酸化肽段與顯著差異代謝產(chǎn)物的Pearson相關(guān)系數(shù)矩陣熱圖Fig.2 Heat map of pearson correlation matrix of all significantly differential phosphor-peptides and metabolites

隨后本研究對滿足相關(guān)系數(shù)值r≥0.50和P<0.05的差異磷酸化肽段和代謝產(chǎn)物，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，用以篩選影響整體代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的、最關(guān)鍵的磷酸化蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物節(jié)點，分析發(fā)現(xiàn)膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸二羥基丙酮、腺嘌呤、蘋果酸、谷胱甘肽二硫化物等代謝產(chǎn)物與多個磷酸化肽段密切相關(guān)；CamkⅡa、Mbp、Ttll7、Arpp19、Gsto1、Dgkz、Adcy9等多個蛋白的磷酸化肽段與多個代謝產(chǎn)物密切相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

3.1 多組學(xué)研究及應(yīng)用進展

組學(xué)作為現(xiàn)代常用的高通量檢測手段具備強大的生物信息學(xué)解析能力，已成為揭示疾病嚴(yán)重程度、預(yù)后轉(zhuǎn)歸、篩查預(yù)測疾病生物標(biāo)志物的有力工具，可為疾病病理機制和治療方案提供新視角[7]。多組學(xué)分析在免疫炎癥[8]、腫瘤[9]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[10]等疾病研究中均有應(yīng)用報道。

3.2 膽堿能突觸信號通路失調(diào)

有研究表明抑郁癥對大腦膽堿(choline，Cho)水平有顯著影響[11]，其差異程度與抑郁癥的嚴(yán)重程度正相關(guān)[12]，且子代表現(xiàn)較少的社會退縮行為與母親產(chǎn)前Cho水平正相關(guān)[11]。Cho作為調(diào)節(jié)記憶儲存的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)的前體，通過反饋機制在Ach釋放調(diào)節(jié)中起重要作用。膽堿誘導(dǎo)突觸前α7-nAChR激活導(dǎo)致ACh釋放下調(diào)。這一級聯(lián)反應(yīng)有賴于鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II，CamkII)的活性[13]。

CamkⅡ，一種普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是突觸后致密物的主要組成部分。在突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶中起關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)樹突棘上的離子型谷氨酸受體和突觸后致密物影響突觸功能[14]。CamkⅡ各亞型突變會導(dǎo)致小鼠嚴(yán)重的可塑性及學(xué)習(xí)障礙，各亞型具有獨特的生理功能且高度同源[15-16]。CamkⅡ的三個亞型CamkⅡa、CamkⅡb、CamkⅡg在PS-S大鼠海馬中均出現(xiàn)了顯著的磷酸化水平改變。CamkⅡ與抑郁癥的相關(guān)研究較少，推測CamkⅡ的磷酸化水平改變可能導(dǎo)致突觸功能受損，從而在PS致子代抑郁樣行為的過程中發(fā)揮重要作用，或可成為深入研究該誘導(dǎo)機制的新思路。

本研究發(fā)現(xiàn)CamkⅡ的三個亞型磷酸化水平改變的同時，共同參與膽堿能突觸途徑的代謝產(chǎn)物膽堿含量在PS-S大鼠海馬中也發(fā)生了變化。上述4個分子是差異磷酸化肽段和代謝產(chǎn)物構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系中的關(guān)鍵節(jié)點，很可能作為海馬區(qū)域影響整體代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵磷酸化蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用。

3.3 長時程增強信號通路失調(diào)

N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)在中樞興奮性突觸的可塑性中起重要作用[17]，目前認(rèn)為編碼NMDAR亞單位的Grin2a是癲癇的致病基因，該基因突變與神經(jīng)發(fā)育障礙密切相關(guān)[18]，且在女性抑郁癥患者中水平較高[19]，母嬰分離應(yīng)激會增加子代成年大鼠海馬中Grin2a的轉(zhuǎn)錄水平[20]。本研究發(fā)現(xiàn)Grin2a磷酸化水平在PS-S大鼠大腦海馬中顯著增高，推測子代胚胎期發(fā)育過程受PS影響，調(diào)節(jié)Grin2a的內(nèi)源性磷酸化水平升高，最終導(dǎo)致NMDAR的轉(zhuǎn)運減少及突觸可塑性受損，該蛋白的磷酸化水平改變可能在PS誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。

整合富集分析顯示差異磷酸化肽段和差異代謝產(chǎn)物顯著富集在長時程增強(long-term potentiation，LTP)等谷氨酸代謝途徑，包含4個磷酸化肽段Grin2a、Cacna1c、Adcy9、Shank3和1個代謝產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸。本研究為長時程增強等谷氨酸系統(tǒng)失調(diào)參與抑郁癥的發(fā)病機制提供佐證。

NMDAR活化及Ca2+內(nèi)流可以觸發(fā)谷氨酸能傳遞的LTP[21]。僅當(dāng)谷氨酸從突觸前末端釋放時，才能活化NMDAR，使Ca2+通過NMDAR進入突觸并觸發(fā)后續(xù)多個級聯(lián)效應(yīng)。在LTP中，CamkⅡ被Ca2+激活并自身磷酸化[21]，隨后轉(zhuǎn)移到突觸與NMDAR結(jié)合，LTP過程需要CamkⅡ的激活，CamkⅡ作為NMDAR依賴性LTP的關(guān)鍵酶發(fā)揮核心作用[22]。有研究發(fā)現(xiàn)NMDAR抑制劑和CamkⅡ抑制劑均可以降低CamkⅡ磷酸化水平[23]。大量證據(jù)表明CamkⅡ與NMDAR的相互作用在維持突觸強度方面起重要作用。

本研究中，突觸相關(guān)蛋白Grin2a、CamkⅡa、CamkⅡb、CamkⅡg的磷酸化修飾水平異常及L-谷氨酸的代謝異常，提示膽堿能突觸及相關(guān)的LTP信號通路，在PS誘導(dǎo)抑郁樣子代大鼠海馬的分子變化中發(fā)揮著主要作用，很可能是該區(qū)域差異分子產(chǎn)生的核心調(diào)控機制。