宋瑾萱，張倩楠，王秀青

(寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是假單胞菌屬中的主要種別，在自然界中普遍存在，是極易引起醫(yī)院感染的革蘭陰性條件致病菌。該菌感染主要見于免疫力低下者，如幼兒、年老體弱者，患有惡性腫瘤、艾滋病等免疫功能受損的患者。

環(huán)二鳥苷酸(cyclic-diguanosine monophosphate, c-di-GMP)作為細菌內(nèi)廣泛存在的一類第二信使分子，參與調(diào)節(jié)細菌運動、黏附、毒力以及生物膜形成等多種生理活動，在微生物感染過程中發(fā)揮重要作用[1]。細菌胞內(nèi)c-di-GMP濃度取決于其在胞內(nèi)的合成與分解速率。含GGDEF結(jié)構(gòu)域的鳥苷酸環(huán)化酶(DGCs)可將兩分子的GTP合成c-di-GMP，而含EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域的特異性磷酸二酯酶(PDEs)又可將合成的c-di-GMP催化水解[2]。HD-GYP是參與細菌第二信使分子c-di-GMP水解的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在霍亂弧菌(Vibriocholerae)El Tor體內(nèi)，HD-GYP蛋白過表達降低細胞內(nèi)c-di-GMP濃度，減少胞外多糖的產(chǎn)生和生物膜形成[3]。銅綠假單胞菌PAO1基因組編碼三種具有HD-GYP結(jié)構(gòu)域的蛋白：PA4781、PA4108和PA2572。并且PA4781、PA4108和PA2572的突變對銅綠假單胞菌的生物膜形成及運動能力有明顯的影響[4]。

PA4781是c-di-GMP的磷酸二酯酶，參與c-di-GMP降解，c-di-GMP影響細菌的運動、生物膜的形成等生理生化過程[4]。眾多生理過程中，運動能力尤為重要，銅綠假單胞菌的運動能力包括泳動(swimming)、叢動(swarming)和蹭行運動(twit-ching)，已被證明與其生物膜形成和致病力都具有顯著的聯(lián)系[5]。胞外多糖是細菌生物膜最主要的組成成分，在生物膜發(fā)育中具有關(guān)鍵作用。銅綠假單胞菌可以分泌3種胞外多糖，即Psl、Pel和藻酸鹽[6]。Pel多糖和Psl多糖都可以作為生物被膜基質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分，不同的胞外多糖對銅綠假單胞菌的毒力因子及形成生物被膜的能力都有不同的影響。胞外DNA與胞外多糖一樣，在細菌生物膜形成的初始階段也發(fā)揮重要作用。胞外積累的 DNA 構(gòu)成生物膜的骨架，與胞外多糖共同作用來維持生物膜的穩(wěn)定性[7]。此外，銅綠假單胞菌能夠分泌許多的胞外毒力因子導致宿主細胞的感染，比如綠膿菌素、外毒素A、彈性蛋白酶、鼠李糖脂等[8]。綠膿菌素不但易滲透細胞膜，而且能干擾來自宿主細胞內(nèi)過氧化氫酶和電子的轉(zhuǎn)移過程，產(chǎn)生活性氧(ROS)[9]，被認為是主要的毒力因子。彈性蛋白酶是銅綠假單胞菌產(chǎn)生的3種具有廣泛特異性底物蛋白酶中的一種，這種酶具有組織損傷活性，在局部感染中起重要作用[10]。因此，銅綠假單胞菌的毒力因子及運動能力在病原菌感染時起重要作用，研究其機制對防治銅綠假單胞菌感染具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 銅綠假單胞菌PA03為臨床分離株，由寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院實驗中心提供，PA4781過表達株pMP2444-PA4781及敲除株pnCasPA-BEC-ΔPA4781為本實驗室構(gòu)建和保存[11]，均為單株。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基；叢動培養(yǎng)基(g/L)：LB培養(yǎng)基，葡萄糖5 g，瓊脂粉5 g，定容至1 L，105Pa滅菌20 min；泳動培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉3 g，定容至1 L，105Pa滅菌20 min。

1.1.3 試劑及儀器設(shè)備 硫酸慶大霉素，北京Solarbio公司；細胞/細菌總RNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物，生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；電泳儀，北京六一儀器廠；ABI7500 PCR儀，美國Thermo公司。

1.1.4 引物設(shè)計與合成 利用NCBI數(shù)據(jù)庫及Primer Premier 6.0軟件，設(shè)計相關(guān)基因及1個內(nèi)參基因(RpoD)的引物序列，用BLAST檢驗引物的特異性，并送由上海生工公司合成。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 復蘇銅綠假單胞菌野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達菌株pMP2444-PA4781于LB平板上37℃倒置培養(yǎng)15 h后，挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min震蕩過夜培養(yǎng)(為維持質(zhì)粒穩(wěn)定性，需在敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達菌株pMP2444-PA4781培養(yǎng)基中加入慶大霉素)，取1%菌液進行放大培養(yǎng)約2.5 h，調(diào)整菌液濃度至0.5麥氏單位。

1.2.2 細菌運動試驗 提前配制好3種運動所用的培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至40℃傾注平板，室溫放置，使培養(yǎng)皿蓋上的水蒸氣蒸發(fā)后備用；泳動和叢動試驗分別吸取2 μL調(diào)好濃度的菌液點在平板標記位點；蹭行運動試驗先用槍頭將培養(yǎng)基穿透，于穿透的地方輕點2 μL調(diào)好濃度的菌液。待菌液被培養(yǎng)基吸收后，平穩(wěn)移入37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.2.3 剛果紅染色法檢測胞外多糖 提前準備好LB平板，其中含有20 μg/mL的考馬斯亮藍、40 μg/mL的剛果紅；吸取5 μL調(diào)好濃度的菌液輕點于LB平板中央，待菌液稍干后移入37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 苯酚-硫酸法檢測胞外多糖 取調(diào)好濃度的菌液于4℃下13 000 r/min離心20 min，上清液用0.22 μm過濾器除菌，向過濾后的上清液中加入3倍體積的無水乙醇，4℃過夜沉淀，次日4℃下13 000 r/min離心15 min，棄上清，用1 mL蒸餾水重懸管壁上的胞外多糖沉淀。

稱取2.5 mg標準葡萄糖，于25 mL的容量瓶中，制成100 mg/L的標準葡萄糖溶液。準確吸取標準葡萄糖溶液10、20、30、40 μL，加蒸餾水補足至100 μL，配制成濃度分別為10、20、30、40 μg/mL的葡萄糖溶液，加入200 μL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速滴加500 μL濃硫酸，混勻后室溫放置10 min，40℃水浴鍋加熱15 min，取出室溫靜置5 min冷卻后于490 nm處測定吸光度值。以標準葡萄糖溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

分別取不同菌株的胞外多糖沉淀，按同樣的方法進行顯色，將所得值帶入標準曲線計算得到相應的多糖含量。

1.2.5 生長曲線測定 分別取過夜培養(yǎng)的菌液，用酶標儀測量其在600 nm的OD值，用LB培養(yǎng)基稀釋至菌液OD初始值為0.05，接種至96孔板，放置于搖床180 r/min，37℃培養(yǎng)，每隔2 h用酶標儀測量其在600 nm處的OD值，至24 h。用不同時間測定獲得的不同OD值繪制菌株生長曲線。

1.2.6 胞外DNA試驗 分別取培養(yǎng)6、12、24、36 h的野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達菌株pMP2444-PA4781的菌液1.5 mL 10 000 r/min離心10 min，取上清液與兩倍體積冰凍保存的無水乙醇充分混勻后放入-20℃冰箱30 min，取出后12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 mL 70%乙醇(-20℃預冷)，隨即12 000 r/min離心10 min，棄上清，放入超凈工作臺中吹干多余液體，向其中加入20 μL雙蒸水-20℃保存。次日取各個樣品在1%瓊脂糖凝膠中電泳，觀察結(jié)果。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 取復蘇后野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達菌株pMP2444-PA4781于LB液體培養(yǎng)基中37℃，180 r/min震蕩過夜，過夜培養(yǎng)后，取1%菌液放大培養(yǎng)5 h，按照細胞/細菌總RNA提取試劑盒說明操作，提取細菌總RNA，并測定其濃度在合適范圍內(nèi)。

加入各RNA樣品500 ng，按RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，42℃孵育15 min，85℃加熱5 s失活EasyScript RT/RI與gDNA Remover，將提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃冷凍保存。

以RpoD為內(nèi)參，以cDNA為模板，引物序列見表1，按照RT-qPCR試劑盒說明進行操作。反應條件為：94℃預變性 30 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，45 cycles，60℃單次采集熒光，繪制熔解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。

1.2.8 胞外蛋白酶檢測 在LB培養(yǎng)基中加入20%的脫脂奶粉溶液10 mL，混勻后傾注平板；將不同檢測菌株調(diào)成0.5麥氏單位菌液，吸取菌液5 μL輕點于牛奶平板中央，待菌液干燥后將平板正置于37℃培養(yǎng)24 h。觀察牛奶平板中蛋白被水解的透明圈，并測量、記錄其直徑，即為蛋白酶水解能力。

2 結(jié)果

2.1 PA4781對細菌運動能力的影響 為研究PA4781對銅綠假單胞菌運動能力的影響，分別測定野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達菌株pMP2444-PA4781的泳動、叢動和蹭行運動能力。測量細菌運動直徑并進行統(tǒng)計分析，相比于野生型菌株P(guān)A03，PA4781敲除菌株的泳動能力減弱，PA4781過表達菌株的泳動能力增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖1。與PA03野生型菌株相比，PA4781敲除菌株的叢動能力減弱，PA4781過表達菌株的叢動能力增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖2。相比于PA03野生型菌株，PA4781敲除菌株的蹭行運動能力減弱，PA4781過表達菌株的蹭行運動能力增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

進一步研究PA4781與蹭行運動相關(guān)的PilZ基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果表明，與野生型菌株P(guān)A03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781的PilZ mRNA的相對表達量下降，過表達菌株pMP2444-PA4781的PilZ mRNA的相對表達量增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。

2.2 PA4781對細菌胞外多糖的影響 對銅綠假單胞菌胞外多糖的表型進行觀察，結(jié)果顯示，相比于野生型菌株P(guān)A03，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781剛果紅染色加深，分泌的胞外多糖增多；過表達菌株pMP2444-PA4781染色變淺，分泌的胞外多糖減少，見圖5。

采用苯酚-硫酸法定量測定銅綠假單胞菌胞外多糖的量，繪制葡萄糖溶液的標準曲線，見圖6。標準回歸曲線方程為y=0.000 89x+0.108 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 4，多糖含量的高低與吸光度呈線性關(guān)系。然后由標準曲線回歸方程計算出野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達菌株pMP2444-PA4781的糖濃度，并計算樣品糖含量。結(jié)果顯示，與野生型菌株P(guān)A03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781的胞外多糖產(chǎn)量增多；過表達菌株pMP2444-PA4781的胞外多糖產(chǎn)量減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖7。

PelA(PA3064)是Pel多糖合成位點基因之一。通過RT-qPCR檢測PA4781對PelA基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，與野生型菌株P(guān)A03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781的PelA mRNA的相對表達量增高，過表達菌株pMP2444-PA4781的PelA mRNA的相對表達量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖8，與胞外多糖的表型變化一致。

2.3 PA4781對細菌胞外DNA的影響 繪制野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781以及過表達菌株pMP2444-PA4781的生長曲線，結(jié)果顯示，在0～12 h，3株菌株均呈對數(shù)生長狀態(tài)，11 h達到平臺期，之后生長趨于平緩。對3株菌株生長曲線進行統(tǒng)計學分析，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖9。電泳結(jié)果表明，從6 h開始，胞外DNA開始積累，隨時間推移，含量逐漸增多，24 h達到最大；36 h胞外DNA含量已下降。在12、24 h，野生型菌株P(guān)A03的胞外DNA大量積累，相比于野生型菌株P(guān)A03，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達菌株pMP2444-PA4781的含量相對較少，見圖10。

2.4 PA4781對PhzM基因表達的影響 通過RT-qPCR研究控制綠膿菌素產(chǎn)生的基因PhzM(PA4209)mRNA的變化。結(jié)果顯示，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達菌株pMP2444-PA4781的PhzM mRNA的相對表達量低于野生型菌株P(guān)A03，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖11。

2.5 PA4781對細菌胞外蛋白酶的影響 通過對菌斑在牛奶平板中透明圈的直徑進行測量并統(tǒng)計分析，與野生型菌株P(guān)A03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達菌株pMP2444-PA4781的蛋白酶水解能力均有下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖12。

3 討論

銅綠假單胞菌是引起醫(yī)院感染的主要條件性致病菌之一。c-di-GMP作為細菌中普遍存在的第二信使，不但能夠調(diào)控鞭毛和纖毛的形成，而且還能通過調(diào)控因子或與蛋白結(jié)合來間接或直接地調(diào)控細菌的運動性[12]。銅綠假單胞菌的運動包括泳動、叢動和蹭行運動，這些運動能力在感染過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細菌的泳動主要依賴于鞭毛提供動力[13]，叢動依賴于鞭毛和Ⅳ型菌毛的共同作用，蹭行運動同樣依賴于鞭毛的運動和Ⅳ型菌毛的伸展和收縮，使得銅綠假單胞菌在感染時可以迅速到達感染部位，有利于生物膜的黏附和形成[14]。生物膜的形成增強了細菌抵御宿主免疫防御系統(tǒng)及抗菌藥物的能力，同時鞭毛促進了細菌的遷移和擴散，進而促進病原菌與宿主的相互作用[15]。銅綠假單胞菌的運動能力、生物膜的形成及毒力因子的產(chǎn)生都對患者的感染及遷延不愈有重要的影響，因此，對于相關(guān)表型的研究尤為重要。

PA4781是銅綠假單胞菌中含有HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶，能夠促進c-di-GMP水解。細胞表面附屬物(主要為鞭毛和Ⅳ型菌毛)通過影響細菌遷移和固體表面附著，在生物被膜的形成中發(fā)揮重要作用[16]。銅綠假單胞菌能夠通過鞭毛的揮鞭運動在液體中泳動，并能夠通過Ⅳ型菌毛的伸展和收縮在固體表面蹭行。細菌的這種遷移能力使其在發(fā)育過程中具有廣泛的運動性、競爭性和選擇性[17]。PilZ是一種介導蹭行運動的Ⅳ型菌毛形成所必須的，被c-di-GMP結(jié)合而激活，幫助生物被膜微菌落的聚集[18]。本研究利用本實驗室前期構(gòu)建的菌株，對PA4781的功能進行進一步研究。通過對其運動能力和Ⅳ型菌毛基因PilZ的研究，發(fā)現(xiàn)PA4781敲除菌株的運動能力弱于野生型菌株，PA4781過表達菌株的運動能力強于野生型菌株，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同時PA4781敲除菌株P(guān)ilZ的mRNA相對表達量低于野生型菌株，PA4781過表達菌株P(guān)ilZ的mRNA相對表達量高于野生型菌株，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，因此說明PA4781可能通過促進基因PilZ的表達，從而增強細菌的運動能力。

研究[4]表明，PA4781對生物膜的形成有一定的影響，因此，應著重于生物膜中兩個重要的組成成分，胞外多糖和胞外DNA。胞外多糖是生物膜細胞外基質(zhì)的骨架成分，其黏性使菌細胞聚集形成封閉環(huán)境以抵御逆境脅迫，而c-di-GMP可經(jīng)合成酶依賴途徑參與調(diào)控胞外多糖的合成與轉(zhuǎn)運[19]。研究[20]表明，細菌內(nèi)高濃度的c-di-GMP可促進生物膜形成，低濃度的c-di-GMP可抑制生物膜形成。銅綠假單胞菌可以合成至少3種類型的胞外多糖：褐藻多糖、Pel多糖和Psl多糖。Pel多糖可以將不同種菌株連接在一起，從而促進混合生物被膜的形成[21]。Pel多糖還可以與生物被膜基質(zhì)中的另一重要組分，胞外DNA通過正負離子間相互吸引而交聯(lián)在一起，促進生物被膜的穩(wěn)定性。

胞外DNA被認為是促進銅綠假單胞菌生物被膜形成的重要因子，其既可以作為生物被膜的支撐成分，也可以在營養(yǎng)缺乏時期為生物膜內(nèi)細菌提供營養(yǎng)[22]。胞外DNA的主要結(jié)構(gòu)與細菌基因組染色體DNA相似，其主要來源于死亡細菌的裂解、釋放或活細菌的主動分泌，參與細菌細胞的初始附著、細胞-細胞的互連和生物被膜大菌落的形成。在銅綠假單胞菌生物被膜形成的初期，胞外DNA含量較少，大量DNA的釋放則是在生物膜形成的晚期，這也與晚期有較多細菌死亡裂解有關(guān)[23]。

通過對胞外多糖和胞外DNA的含量進一步分析發(fā)現(xiàn)，相比于野生型菌株，PA4781過表達菌株的胞外多糖產(chǎn)生減少，PA4781敲除菌株的胞外多糖產(chǎn)生增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，且通過對控制Pel多糖合成的基因——PelA在轉(zhuǎn)錄水平的變化情況發(fā)現(xiàn)，相比于野生型菌株，PA4781敲除菌株P(guān)elA的mRNA相對表達量升高，PA4781過表達菌株P(guān)elA的mRNA相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明PA4781可能通過抑制基因PelA的表達，抑制生物膜細胞外基質(zhì)胞外多糖的產(chǎn)生，從而可能抑制生物膜的形成和穩(wěn)定性；而對于胞外DNA含量，研究發(fā)現(xiàn)在細菌增殖能力相同的情況下，12 h和24 h(生物膜成熟的階段)時野生型菌株的胞外DNA大量積累，相比于野生型菌株，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達菌株pMP2444-PA4781的含量都相對較少。說明PA4781可能不能直接影響胞外DNA的分泌。

綠膿菌素是一種具有氧化活性的吩嗪類化合物，也是銅綠假單胞菌的重要致病因子。作為銅綠假單胞菌的主要毒力因子，綠膿菌素不僅是該菌的群體感應信號分子，也是一種電化學活性代謝物。其被認為是細菌呼吸的電子載體，同時也能協(xié)調(diào)微生物群落對環(huán)境變化的反應[24]。此外，研究[25]表明，綠膿菌素可以通過誘導H2O2介導的細胞裂解促進胞外DNA的釋放，從而促進生物膜的形成。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，PA4781過表達菌株綠膿菌素的產(chǎn)生量遠低于PA4781敲除菌株和野生型菌株，因此檢測控制綠膿菌素的基因PhzM的表達量的變化。結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，相比于野生型菌株，PA4781過表達菌株和PA4781敲除菌株的基因表達量大幅度下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明PA4781可能不能直接影響綠膿菌素的合成，這也可以解釋胞外DNA有同樣的變化，從而引起后期深入的研究。

蛋白水解酶也是銅綠假單胞菌的重要毒力因子之一，包括彈性蛋白酶A和B、堿性蛋白酶等，對于不同的蛋白都有一定的水解能力，在急性感染中發(fā)揮重要作用。對野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達菌株pMP2444-PA4781的胞外蛋白酶總活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株P(guān)A03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達菌株pMP2444-PA4781的蛋白酶水解能力均有下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，表明PA4781可能不能直接影響銅綠假單胞菌的胞外蛋白水解酶能力。

綜上所述，本研究認為，PA4781可能通過促進基因PilZ的表達，從而促進銅綠假單胞菌的運動能力；PA4781可能通過抑制基因PelA的表達，從而抑制胞外多糖的分泌。同時，PA4781可能不能直接影響胞外DNA分泌量、毒力因子綠膿菌素和胞外蛋白酶的產(chǎn)生。

PA4781作為c-di-GMP的磷酸二酯酶，參與c-di-GMP降解，影響細菌的運動、生物膜的形成等眾多生理過程。本研究基于課題組前期在PA4781對銅綠假單胞菌c-di-GMP及生物膜形成的影響方面的研究，初步探明PA4781對細菌運動能力及毒力因子的影響，但PA4781與其他因素共同作用對細菌致病因子的影響仍有待進一步探討，以期為銅綠假單胞菌感染的治療找到新的靶點，為預防和治療銅綠假單胞菌感染提供新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。