周 興 劉 凱 彭建平 王傳東* 張曉玲

(1 廣西醫(yī)科大學再生醫(yī)學與醫(yī)用生物資源開發(fā)應用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西再生醫(yī)學重點實驗室，廣西南寧市 530021；2 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院骨科實驗室，上海市 200092)

大約有3%的50歲以上成年人因過敏、炎癥或癌癥而接受糖皮質激素治療。長期使用糖皮質激素會產(chǎn)生多種副作用，其中骨質疏松和骨折是其最常見的不良反應[1-5]。地塞米松是臨床常用的一種糖皮質激素，亦是骨質疏松模型的誘導劑, Deng等[6]的研究表明，地塞米松可通過PI3K/AKT/GSK3β信號通路誘導成骨細胞凋亡，體內(nèi)實驗也證明高濃度地塞米松處理的大鼠中堿性磷酸酶、骨鈣素等成骨相關指標表達下調(diào)[7]。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具備多向分化潛能，并且是骨髓中造血系統(tǒng)的關鍵生態(tài)位細胞[8]。在再生醫(yī)學和組織工程等領域中，BMSCs因其成骨分化能力以及低免疫原性而成為理想的“種子細胞”[9]。既往研究也表明，在成人骨髓腔內(nèi)BMSCs是成骨細胞的主要來源[10]。小分子非編碼RNA(small non-coding RNA, sncRNA)包括轉運RNA(transfer RNA，tRNA)、PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA，piRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、重復相關小干擾RNA(repeat associated small interfering RNA，rasiRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)和核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)等[11]。既往研究表明，地塞米松可能通過調(diào)控sncRNA影響骨重建。例如，有研究報道地塞米松通過下調(diào)miR-34a-5p的表達激活下游的Notch信號通路從而抑制BMSCs的成骨分化能力[12]。Hong等[13]的研究表明經(jīng)地塞米松治療后的壞死股骨頭組織中miR-579累積增加。Tang等[14]的研究表明過表達的miR-199a可有效減弱地塞米松對BMSCs成骨分化的抑制作用。然而，地塞米松調(diào)控sncRNA進而影響B(tài)MSCs分化的相關研究目前仍主要集中于miRNA，其他sncRNA的相關研究較少。

以往的芯片測序方法只能局限于已知序列和結構的sncRNA，而高通量small RNA測序技術提供了更高的靈敏度，有助于我們發(fā)現(xiàn)新的sncRNA[15-17]。因此，本研究使用高通量small RNA測序技術，全面地研究地塞米松抑制BMSCs成骨分化過程中sncRNA的表達譜，以了解地塞米松抑制BMSCs成骨分化的潛在分子機制，為后續(xù)深入研究激素性骨質疏松癥的靶向治療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 C57BL/6J小鼠購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司。α-MEM培養(yǎng)基(貨號：B1131-053)和胎牛血清(貨號：BN1630-149)購自BIOEXPLORER公司，胰蛋白酶(貨號：25200072)購自ThermoFisher公司，青鏈霉素雙抗(貨號：E607011-0100)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，茜素紅(貨號：A5533)、地塞米松(貨號：D4902)、維生素C(貨號：A5960)和β-甘油磷酸鈉(貨號：G9422)購自Sigma公司。酶標儀(型號：infinite M200 PRO)購自TECAN公司。

1.2 C57BL/6J小鼠BMSCs分離培養(yǎng) 取雄性3～4周的C57BL/6J小鼠，使用頸椎脫臼法將其處死，置于75%乙醇中消毒5 min，分離并切除股骨和脛骨上下緣。吸取3 mL左右的α-MEM完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗)將骨頭沖洗至發(fā)白。將骨髓沖洗液接種于6孔板并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。2 d后首次換液，此后每3 d更換一次培養(yǎng)基，約7 d后細胞長滿，將其繼續(xù)傳代培養(yǎng)至第3代用于后續(xù)實驗。本研究已獲得上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準。

1.3 成骨分化誘導 陰性對照組(negative control，NC組)誘導液為含0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L維生素C、104μmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM完全培養(yǎng)基。地塞米松組(dexamethasone，DEX組)誘導液為含10 μmol/L地塞米松、50 μmol/L維生素C、104μmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM完全培養(yǎng)基。將小鼠第3代BMSCs 以2×104個/cm2的密度接種于6孔板，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，待生長融合至60%～70%后，分別更換為NC組和DEX組誘導液繼續(xù)誘導,每組設3個復孔，每3 d更換一次誘導液。

1.4 鈣結節(jié)染色及半定量測定 精確稱量1.37 g茜素紅粉末溶解于100 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)中，并調(diào)節(jié)pH值為4.1～4.3，放置室溫備用。成骨分化誘導結束后去除培養(yǎng)基，使用PBS沖洗2遍，加入1 mL 4%多聚甲醛固定15 min，再使用PBS沖洗2遍，每孔加入1 mL茜素紅染色液，室溫孵育20 min后吸掉染色液，使用PBS沖洗2遍后進行拍照。每孔加入1 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液溶解茜素紅鈣結節(jié)，然后震蕩混勻，吸取100 μL的裂解液加入96孔板中，利用酶標儀檢測548 nm處的吸光度值。

1.5 高通量small RNA測序 NC組和DEX組均在誘導3 d后去除培養(yǎng)基，6孔板中每孔加入2 mL PBS洗滌2遍后棄除，接著在每個孔中加入1 mL TRIzol試劑溶解RNA，將溶解液放置在-80 ℃冰箱中，樣品提交給生工生物工程(上海)股份有限公司進行后續(xù)實驗。實驗主要流程包括從總RNA中分離small RNA、逆轉錄PCR擴增、small RNA建庫純化，最后采用Illumina Hiseq 2500平臺進行測序。

1.6 生物信息學分析 生物信息學分析主要包括使用Trimmomatic軟件過濾原始數(shù)據(jù)、Bowtie軟件比對參考基因組、DESeq2軟件進行差異基因分析、R軟件vegan包進行主成分分析。miRNA差異基因篩選標準為倍數(shù)變化(Fold Change)≥2且P<0.05，piRNA、rasiRNA、snoRNA、snRNA差異基因篩選標準為倍數(shù)變化(Fold Change)≥1.5且P<0.05。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 茜素紅染色與鈣結節(jié)含量檢測結果 茜素紅染色結果顯示，與NC組相比，DEX組茜素紅染色變淺(圖1A)。對茜素紅染色進行半定量檢測，結果顯示，與NC組相比，DEX組鈣結節(jié)含量顯著降低(P<0.01)。見圖1B。

2.2 miRNA的表達 熱圖分析結果顯示NC組和DEX組miRNA的表達模式存在差異(圖2A)。火山圖顯示，與NC組相比，DEX組中有6個miRNAs表達上調(diào)，19個miRNAs表達下調(diào)(圖2B)。DEX組與NC組的差異基因中，|log2Fold Change|≥1的miRNAs有25個，其中DEX組的6個miRNAs表達上調(diào)，19個miRNAs表達下調(diào)(均P<0.05)，見表1。主成分分析結果顯示，基于miRNA差異表達情況進行數(shù)據(jù)降維，能夠很好地區(qū)分NC組和DEX組，保證分析結果的可靠性(圖2C)。此外，基因本體論(Gene Ontology，GO)分析結果顯示，上調(diào)的差異miRNAs的靶基因主要參與蛋白質磷酸化、肌肉和器官發(fā)育、細胞黏附等生物過程(圖2D)，下調(diào)的差異miRNAs主要參與蛋白質自磷酸化、蛋白質泛素化、細胞內(nèi)雌激素受體信號通路、細胞增殖等生物過程(圖2E)。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析顯示，上調(diào)的差異miRNAs主要富集在脂肪合成相關信號通路、Ras信號通路、鈣信號通路等(圖2F)，下調(diào)的差異miRNAs主要富集在Wnt信號通路、Hippo信號通路等(圖2G)。

表1 DEX組與NC組差異表達的miRNAs

圖2 兩組miRNA的表達

2.3 piRNA的表達 熱圖分析結果顯示NC組和DEX組piRNA的表達模式存在差異(圖3A)?；鹕綀D顯示，與NC組相比，DEX組中有34個piRNAs表達上調(diào)，6個piRNAs表達下調(diào)(圖3B)。DEX組與NC組的差異基因中，|log2Fold Change|≥1的piRNAs有3個，其中DEX組的mmu_piR_025570表達上調(diào)，mmu_piR_026493、mmu_piR_026351表達下調(diào)(均P<0.05)。主成分分析顯示，基于piRNA差異表達情況進行數(shù)據(jù)降維，能夠很好地區(qū)分NC組和DEX組，保證分析結果的可靠性(圖3C)。

圖3 兩組piRNA的表達

2.4 rasiRNA的表達 熱圖分析結果顯示NC組和DEX組rasiRNA的表達模式存在差異(圖4A)。火山圖顯示，與NC組相比，DEX組中有3個rasiRNAs表達上調(diào)，2個rasiRNAs表達下調(diào)(圖4B)。DEX組與NC組的差異基因中，|log2Fold Change|≥1的rasiRNAs有2個(LTR、LTR/ERV1)，兩者在DEX組中的表達均上調(diào)(均P<0.05)。主成分分析顯示，基于rasiRNA差異表達情況進行數(shù)據(jù)降維，能夠很好地區(qū)分NC組和DEX組，保證分析結果的可靠性(圖4C)。

圖4 兩組rasiRNA的表達

2.5 snoRNA的表達 熱圖分析結果顯示NC組和DEX組snoRNA的表達模式存在差異(圖5A)?；鹕綀D顯示，與NC組相比，DEX組中有12個snoRNAs表達上調(diào)，11個snoRNAs表達下調(diào)(圖5B)。DEX組與NC組的差異基因中，|log2Fold Change|≥1的snoRNAs有8個，其中DEX組有6個snoRNAs表達上調(diào)，2個snoRNAs表達下調(diào)(均P<0.05)，見表2。主成分分析顯示，基于snoRNA差異表達情況進行數(shù)據(jù)降維，能夠很好地區(qū)分NC組和DEX組，保證分析結果的可靠性(圖5C)。

表2 DEX組與NC組差異表達的snoRNAs

圖5 兩組snoRNA的表達

2.6 snRNA的表達 火山圖分析表明，與NC組相比，DEX組中有3個snRNAs表達下調(diào)(圖6A)。差異基因中，|log2Fold Change|≥1的snRNA僅有ENSMUSG00000064856，該基因在DEX組中的表達下調(diào)(P<0.05)。主成分分析顯示，基于snRNA差異表達情況進行數(shù)據(jù)降維，能夠很好地區(qū)分NC組和DEX組，保證分析結果的可靠性(圖6B)。

圖6 兩組snRNA的表達

3 討 論

骨質疏松癥的常見病因包括雌激素缺乏、某些藥物如糖皮質激素的大量使用、吸煙以及遺傳因素等[18]。糖皮質激素可以影響骨重建中的多種細胞類型，包括BMSCs、成骨細胞、破骨細胞等[6,19-21]。長期使用糖皮質激素類藥物可促進BMSCs的凋亡進而導致骨形成減少[22]。由此可見，深入研究糖皮質激素抑制BMSCs成骨分化潛在的分子機制，對于理解糖皮質激素治療后發(fā)生骨質疏松癥等疾病至關重要。

本研究結果顯示，與NC組相比，DEX組茜素紅染色變淺，鈣結節(jié)含量顯著降低(P<0.001)。王偉等[23]使用0.001 μmol/L至10 μmol/L濃度的地塞米松誘導脂肪來源的干細胞成骨分化，結果顯示0.01μmol/L濃度的地塞米松誘導成骨后其礦化程度達到最高峰，而隨著地塞米松濃度的升高，干細胞成骨分化能力被顯著抑制。由此可見，高濃度地塞米松顯著抑制BMSCs的成骨分化能力。

本研究的測序結果主要包括miRNA、piRNA、rasiRNA、snoRNA和snRNA五大類，其中miRNA、piRNA、snoRNA為有較多顯著性差異表達的基因。本研究結果顯示，DEX組miR-490-3p、miR-451a、miR-675-3p、miR-150-5p的表達顯著下調(diào)(均P<0.05)。既往研究結果顯示，在胸椎黃韌帶骨化疾病中，過表達miR-490-3p可直接靶向FOXO1并抑制其表達，從而負調(diào)控胸椎黃韌帶細胞的成骨分化[24]。此外，miR-451a、miR-675-3p等靶向骨形態(tài)發(fā)生蛋白通路調(diào)控骨形成[25]。Wang等[26]的研究表明miR-150-5p與BMSCs成骨分化正相關。然而，上述基因在地塞米松抑制成骨分化中的作用尚未完全明確。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了mmu-novel-1、mmu-novel-121等尚未被數(shù)據(jù)庫收錄的miRNAs，這些miRNAs具體的生物學功能有待后續(xù)進一步研究。

GO分析和KEGG分析表明，高濃度地塞米松上調(diào)的miRNAs主要富集的信號通路與脂肪合成相關，而下調(diào)的miRNAs主要富集于Wnt信號通路、Hippo信號通路，這些信號通路與成骨相關[27-28]。He等[29]報道在地塞米松誘導的骨質疏松癥模型中，過氧化物酶體增殖物激活受體-γ表達增強，并通過靶向Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化。此外，地塞米松處理后的干細胞外泌體中miR-365a-5p可有效激活Hippo信號通路進而促進成骨分化[30]。因此，這提示了高濃度地塞米松可能靶向調(diào)控多個miRNAs及通路，通過促進BMSCs成脂肪分化能力以及抑制成骨分化能力等加重骨骼穩(wěn)態(tài)失衡。

本研究發(fā)現(xiàn)了34個piRNAs表達呈顯著性上調(diào)，而有6個piRNAs表達顯著性下調(diào)；3個rasiRNAs表達顯著性上調(diào)，而有2個rasiRNAs表達顯著性下調(diào)；12個snoRNAs表達顯著性上調(diào)，11個snoRNAs表達顯著性下調(diào)；3個snRNAs表達顯著性下調(diào)。本研究中，DEX組的LTR顯著上調(diào)了4.5倍左右(P<0.05)，既往研究報道LTR是骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的下游靶基因，但其對于成骨分化的作用尚未明確[31]。其他的piRNA、rasiRNA、snoRNA和snRNA目前尚無可用的數(shù)據(jù)庫進行功能預測，未來需要進行更多的研究探索這些sncRNAs在糖皮質激素抑制BMSCs成骨分化過程中的作用。

本研究通過使用高通量small RNA測序技術檢測地塞米松抑制BMSCs成骨分化過程中sncRNA的表達情況，這些sncRNA受到地塞米松調(diào)控并且可能通過下游靶基因間接調(diào)控BMSCs的成骨分化潛能，這也提示了表觀遺傳修飾在其中的廣泛參與。本課題組將在后續(xù)研究中篩選出預測miRNA的靶基因，此外在細胞和動物模型上進一步驗證相關的miRNA在激素性骨質疏松癥中的生物學功能。目前除miRNA以外的sncRNA尚缺乏成熟的生物學方法進行驗證，且其相關的數(shù)據(jù)庫尚未完善，因此我們將繼續(xù)深入研究這些sncRNAs及其靶基因，為未來糖皮質激素誘導的骨質疏松癥的治療提供新的理論基礎。