葛 欣

中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，遼寧沈陽 110016

根治性手術(shù)是目前國內(nèi)外所公認(rèn)的治療膽囊癌最有效手段，然而因該病早期具有極強(qiáng)的隱匿性，導(dǎo)致絕大部分一經(jīng)確診便已是中晚期，喪失了手術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)，預(yù)后普遍不良。因此，如何有效早期診斷膽囊癌對改善患者預(yù)后具有極其重要的意義。MiRNA是近年來所發(fā)現(xiàn)的一類長度在21～25 個(gè)核苷酸的小分子RNA，可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[1-3]。且有研究報(bào)道證實(shí)[4-6]，miRNA-187 在乳腺癌以及宮頸癌等腫瘤細(xì)胞中存在異常表達(dá)；miRNA-143 在胃癌以及膀胱癌中存在異常低表達(dá)。然而，關(guān)于上述兩種miRNA 在膽囊癌中的表達(dá)研究并不多見[7-8]。鑒于此，本文通過研究血清miRNA-187、miRNA-143 和膽囊癌病理特征的關(guān)系及二者診斷膽囊癌的價(jià)值并予以分析，以期為膽囊癌的診斷提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年9月至2021年3月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的92 例膽囊癌患者為膽囊癌組，另取同期收治的80 例膽囊良性疾病患者作為膽囊良性疾病組，再選取同期健康體檢者80 例作為健康對照組。膽囊癌組中，男32 例，女60 例；年齡34～79 歲，平均（62.62±10.34）歲；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期31 例，Ⅲ～Ⅳ期61 例；分化程度：低分化23 例，中高分化69 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51 例。膽囊良性疾病組中，男28 例，女52 例；年齡32～79 歲，平均（62.71±10.31）歲；疾病類型：膽結(jié)石32 例，膽囊腺肌癥11例，膽囊炎30 例，膽囊穿孔7 例。健康對照組中，男27例，女53 例；年齡31～82 歲，平均（62.66±10.25）歲。三組研究對象的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有入組人員均經(jīng)手術(shù)病理檢查確診；②均為成年人；③入組前均未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②心、肝、肺等臟器發(fā)生嚴(yán)重病變者；③伴有嚴(yán)重感染性疾病或（和）全身免疫系統(tǒng)疾病者。所有患者及其家屬均對本研究知情同意，并簽署知情同意書；本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本獲取 分別獲取所有人員的晨起空腹靜脈血5 ml，于室溫條件下靜置0.5 h，取上清液進(jìn)行離心處理，轉(zhuǎn)速820 r/min，半徑12 cm，離心10 min。獲取上層血清置于離心管內(nèi)，于常溫條件下實(shí)施16 000 r/min 離心，離心半徑8 cm，離心10 min，取上層血清保存至-80℃冰箱中待檢。

1.2.2 血清miRNA-187及miRNA-143 水平檢測檢測方式為實(shí)時(shí)定量PCR，首先按照微RNANeasy 提取試劑盒說明書完成微RNA 的提取，借助紫外分光度將吸光度比值處于1.8～2.0 的標(biāo)本用作上述血清學(xué)指標(biāo)的檢測。遵循微RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。按照GenBank 中的miRNA-187、miRNA-143 以及U6 序列號，采用Premier Primer 5.0 軟件完成引物的設(shè)計(jì)，由蘇州金唯智生物科技有限公司負(fù)責(zé)引物合成。其中miRNA-187 引物序列如下：正向引物5′-TCGTGTCTTGTGTTGCAGC-3′，反向引物：5′-GTCAGGGTCCGAGGT-3′。miRNA-143 引物序列如下： 正向引物5′-ATGCCCTTTCATCATTGC-3′，反向引物：5′-GAGCTACAGTGCTTC-3′。U6 引物序列如下：正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCGAATTTGCGT-3′。實(shí)時(shí)定量PCR 總反應(yīng)體系25 μl，涵蓋上下游引物各1.0 μl，cDNA 0.8 μl，RNaseH2O 為12.2 μl，SYBRPPrimix Ex TaqTM10 ml。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃10 min，變性95℃5 s，退火60℃60 s，延伸55℃60 s，共40 個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct表示相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；繪制ROC 曲線分析血清miRNA-187及miRNA-143 水平診斷膽囊癌的效能。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清miRNA-187及miRNA-143 水平的比較

膽囊癌組血清miRNA-187 高于膽囊良性疾病組及健康對照組，而miRNA-143 低于膽囊良性疾病組及健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；膽囊良性疾病組血清miRNA-187 高于健康對照組，而miRNA-143 低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 三組血清miRNA-187及miRNA-143 水平的比較（±s）

表1 三組血清miRNA-187及miRNA-143 水平的比較（±s）

注 與膽囊良性疾病組比較，aP＜0.05；與健康對照組比較，bP＜0.05

組別例數(shù)miRNA-187miRNA-143膽囊癌組膽囊良性疾病組健康對照組F 值P 值92 80 80 6.61±1.32ab 3.20±1.01b 1.02±0.31a 42.593＜0.001 0.48±0.13ab 1.33±0.32b 2.25±0.47a 56.739＜0.001

2.2 不同臨床特征膽囊癌患者血清miRNA-187 水平的表達(dá)情況

TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膽囊癌患者的血清miRNA-187 表達(dá)水平均高于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膽囊癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 不同臨床特征膽囊癌患者血清miRNA-187 水平的表達(dá)情況（±s）

表2 不同臨床特征膽囊癌患者血清miRNA-187 水平的表達(dá)情況（±s）

臨床特征例數(shù)miRNA-187t 值P 值性別0.419 0.676男女32 60 6.69±1.36 6.57±1.28年齡（歲）＜60≥60 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中高分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.930 0.355 39 53 6.46±1.26 6.72±1.37 6.643＜0.001 31 61 5.30±1.18 7.26±1.41 5.608＜0.001 23 69 7.87±1.45 6.19±1.17 7.454＜0.001有無41 51 7.74±1.37 5.70±1.25

2.3 不同臨床特征膽囊癌患者血清miRNA-143 水平的表達(dá)情況

TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膽囊癌患者的血清miRNA-143 表達(dá)水平均低于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膽囊癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 不同臨床特征膽囊癌患者血清miRNA-143 水平的表達(dá)情況（±s）

表3 不同臨床特征膽囊癌患者血清miRNA-143 水平的表達(dá)情況（±s）

臨床特征例數(shù)miRNA-143t 值P 值性別1.109 0.270男女32 60 0.50±0.13 0.47±0.12年齡（歲）＜60≥60 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中高分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.829 0.409 39 53 0.49±0.12 0.47±0.11 10.931＜0.001 31 61 0.70±0.20 0.37±0.09 7.879＜0.001 23 69 0.30±0.07 0.54±0.14 8.632＜0.001有無41 51 0.33±0.12 0.59±0.16

2.4 血清miRNA-187及miRNA-143 診斷膽囊癌的效能

分析ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，血清miRNA-187 聯(lián)合miR-NA-143 診斷膽囊癌的AUC、靈敏度、特異度及約登指數(shù)均高于上述兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)診斷（表4、圖1）。

表4 血清miRNA-187及miRNA-143 診斷膽囊癌效能的ROC 曲線分析

圖1 血清miRNA-187及miRNA-143 診斷膽囊癌效能的ROC 曲線

3 討論

MiRNA-187 以及miRNA-143 均是miRNA 家族重要成員之一，是近年來所發(fā)現(xiàn)的兩種新型miRNA，且和多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲密切相關(guān)，甚至具有成為多種惡性腫瘤預(yù)后評估的潛在標(biāo)志物[9-11]。

本研究結(jié)果顯示，膽囊癌組血清miRNA-187 水平高于膽囊良性疾病組，而miRNA-143 水平低于膽囊良性疾病組（P＜0.05）。這在徐順林等[12]的研究報(bào)道中得以佐證，提示了血清miRNA-187 在膽囊癌中異常高表達(dá)，而miRNA-143 異常低表達(dá)，兩者均可能在膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。考慮原因，miRNA-187 的過表達(dá)可促進(jìn)多種促癌基因的過度表達(dá)以及抑制抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增值、轉(zhuǎn)移以及侵襲。miRNA-143 可發(fā)揮調(diào)節(jié)增殖、凋亡相關(guān)蛋白的作用，從而起到抑制腫瘤增殖、分化的作用，在膽囊癌中扮演著抑癌基因的角色。此外，血清miRNA-187 聯(lián)合miRNA-143 診斷膽囊癌的AUC、靈敏度、特異度以及約登指數(shù)均高于上述兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)診斷。這提示了在臨床實(shí)際工作中，可能通過聯(lián)合檢測上述兩項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)水平，繼而達(dá)到早期輔助診斷膽囊癌的目的。究其原因，聯(lián)合檢測具有一定的協(xié)同作用，從抑癌基因以及促癌基因兩個(gè)方面為膽囊癌的診斷提供參考依據(jù)。另外，本研究結(jié)果顯示血清miRNA-187 與miRNA-143 的表達(dá)和膽囊癌患者TNM 分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能即隨著miRNA-187 水平的升高以及miRNA-143 水平的降低，膽囊癌患者TNM 分期越晚，分化程度越低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越大。這在既往相關(guān)研究報(bào)道中均得到類似發(fā)現(xiàn)[13]：結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染miRNA-187之后，其增殖活性顯著升高，且遷移能力顯著增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞的比例存在一定程度的降低。miRNA-143 主要定位于染色體5q32 位點(diǎn)，于惡性腫瘤的增殖、遷移以及藥物抵抗等方面具有極其重要的作用。另有研究報(bào)道顯示，膽囊癌在轉(zhuǎn)染miRNA-143 之后，膽囊癌細(xì)胞的增殖以及遷移能力均得到顯著的抑制，而在轉(zhuǎn)染miRNA-143 抑制劑之后，膽囊癌的細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，遷移能力亦顯著提高，證實(shí)了miRNA-143 和膽囊癌的增殖、遷移關(guān)系密切[14-15]。

綜上所述，膽囊癌患者血清miRNA-187 存在異常高表達(dá)，而miRNA-143 存在異常低表達(dá)，聯(lián)合檢測可能有助于膽囊癌的臨床診斷以及病情評估。