賀繼平，陳曉聰，蘇曉云，門杰，鄒雙玲

（山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西 汾陽 032200）

0 引言

動脈粥樣硬化（ atherosclerosis,AS）是一種對人體健康有害的最常見的慢性心血管疾?。–ardiovascular disease,CVD）[1]，發(fā)病率和死亡率較高，約占世界死亡總?cè)藬?shù)的20%[2]。AS是一種慢性炎癥性疾病，炎癥是AS發(fā)生和發(fā)展過程中存在共同生理、病理基礎(chǔ)[3]。對于AS主要研究集中在機(jī)制[4-5]、治療[6]和預(yù)防[7-8]等方面。炎癥對AS斑塊的發(fā)生和發(fā)展起重要的作用，AS炎癥發(fā)展的標(biāo)志物C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素（IL）-6、黏附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶等作為研究重點(diǎn)，并取得一定成果。Cristina Lorenzo等[9]，通過高通量測序研究發(fā)現(xiàn)，線粒體蛋白ALDH4A1是一種與AS有關(guān)的自身抗原，ALDH4Al在AS過程中分布改變，在AS小鼠和人類患者體內(nèi)表達(dá)增加，ALDH4Al可以作為AS治療的潛在標(biāo)志物。本研究利用在線生物信息學(xué)軟件分析ALDH4Al基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，為ALDH4A1 抗體治療AS的發(fā)生發(fā)展提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

從國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載褐家鼠蛋白序列，GenBank檢索號為P0C2X9.1。

1.2 蛋白理化性質(zhì)的分析

利用在線分析軟件ProtParam對褐家鼠ALDH4A1蛋白氨基酸的組成、分子量、不穩(wěn)定指數(shù)、等電點(diǎn)、消光系數(shù)、平均親水系數(shù)及脂溶系數(shù)等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。用TMHMM Serverv.2.0對該蛋白進(jìn)行跨膜螺旋預(yù)測。用ExPAsy對該蛋白的親水性或疏水性進(jìn)行預(yù)測。

1.3 蛋白功能位點(diǎn)的分析

用NetPhos 3.1 Server預(yù)測褐家鼠ALDH4A1蛋白的磷酸化位點(diǎn)。用SignaIP 4.1 分析ALDH4A1蛋白信號肽。用NetNGlyc1.0Server分析該蛋白N-糖基化位點(diǎn)，分析褐家鼠ALDH4A1蛋白的O-糖基化位點(diǎn)。

1.4 蛋白二、三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

利用Prabi網(wǎng)站，預(yù)測褐家鼠的ALDH4A1蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用SWISSMODEL，預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.5 多序列比對對系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用UniProt在線數(shù)據(jù)庫blast功能，搜索與褐家鼠的ALDH4A1蛋白序列相似性較高的12種動物的ALDH4A1蛋白。使用MEGA7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALDH4A1蛋白的理化性質(zhì)分析

褐家鼠的ALDH4A1蛋白是由563個，共20種氨基酸組成。各種氨基酸含量（見表1），其中，帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）有59個：Glu有 33個，Asp有26個。帶正電荷的氨基酸（Arg+His+Lys）有69個：Arg有30個，His 有10個，Lys 有29個，含量最高的是Ala（為10.3%），其次是Leu（為8.7%）。ALDH4 A1蛋白的分子量為61.869 kD，分子式 C2792H4330N754O806S16，等電點(diǎn)為7.13。該蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的半衰期為30h，脂溶系數(shù)83.88，總體平均親水系數(shù)-0.154。其不穩(wěn)定指數(shù)為41.65；消光系數(shù)為79340（mol/L）-1cm-1。

表1 褐家鼠ALDH4A1蛋白氨基酸的組成

2.2 ALDH4A1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測

通過TMHMM預(yù)測的結(jié)果顯示，ALDH4A1蛋白沒有跨膜螺旋區(qū)（圖1），因此，不屬于跨膜蛋白。

圖1 褐家鼠ALDH4A1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 ALDH4A1蛋白親水或疏水性分析

親水或疏水性預(yù)測的結(jié)果顯示，殘基K461的親水性最強(qiáng)，其Score值為-2.644；F387的疏水性最強(qiáng)，其Score值為1.889；親水氨基酸的數(shù)量遠(yuǎn)多于疏水氨基酸（圖2）。由此可知，褐家鼠ALDH4A1蛋白為親水性蛋白。

圖2 褐家鼠ALDH4A1蛋白親水/疏水性分析

2.4 ALDH4A1蛋白磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測

磷酸位點(diǎn)預(yù)測的結(jié)果顯示，褐家鼠ALDH4A1蛋白共存在44個可能的磷酸化位點(diǎn)，其中，15個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，24個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，5個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（見圖3）。

圖3 褐家鼠ALDH4A1蛋白的磷酸化位點(diǎn)

上述位點(diǎn)及其所對應(yīng)的激酶（表2）。通常情況下，取閾值為0.5，磷酸化勢能越高，結(jié)果的置信度就會越高。當(dāng)某個位點(diǎn)磷酸化的勢能遠(yuǎn)大于0.5時，該位點(diǎn)是磷酸化位點(diǎn)的可能性就很大，反之，則可能性就較小。

表2 ALDH4A1蛋白磷酸化位點(diǎn)及對應(yīng)激酶

2.5 ALDH4A1蛋白信號肽的預(yù)測

根據(jù)SIGNALP 4.0 SERVER網(wǎng)站的在線預(yù)測，ALDH4A1蛋白沒有信號肽的可能性為0.9975，有信號肽的可能性是0.0025。（圖4）。

圖4 褐家鼠ALDH4A1蛋白信號肽預(yù)測

2.6 ALDH4A1蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測

2.6.1 N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測

N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測的結(jié)果顯示，ALDH4A1蛋白共有1個可能的N-糖基化位（圖5），是位于N210位的氨基酸。

圖5 褐家鼠ALDH4A1蛋白N-糖基化位點(diǎn)

2.6.2 O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測

O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測的結(jié)果顯示，ALDH4A1蛋白一共有7個可能的O-糖基化位點(diǎn)（圖6），分別為S75、S186、T191、T273、S324、S409及S551位的氨基酸。

圖6 褐家鼠ALDH4A1蛋白的O-糖基化位點(diǎn)

2.7 ALDH4A1蛋白二級結(jié)構(gòu)

獲得ALDH4A1蛋白序列后，使用Prabi網(wǎng)站對 ALDH4A1蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。其中構(gòu)成α-螺旋結(jié)構(gòu)（Hh）的氨基酸有236個，占41.92%，構(gòu)成延伸鏈結(jié)構(gòu)（Ee）的氨基酸有84占14.92%，構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（Tt）的氨基酸有28個，占4.97%，構(gòu)成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（Cc）的氨基酸有215個，占38.19%（圖7）。

圖7 褐家鼠ALDH4A1蛋白二級結(jié)構(gòu)

2.8 ALDH4A1蛋白三級結(jié)構(gòu)

根據(jù)蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)建立網(wǎng)站構(gòu)建ALDH4A1蛋白的三級結(jié)構(gòu)，如圖8。

圖8 ALDH4A1蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

2.9 ALDH4A1蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)相互 作用的網(wǎng)絡(luò)分析顯示，ALDH4A1（圖9顯示為Iffo2）與10個蛋白之間都存在相互作用，分別是天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Got1），羥脯氨酸脫氫酶（Glul），谷氨酸脫氫酶1（Glud1），鳥氨酸轉(zhuǎn)氨 酶（Oat），脯氨酸脫氫酶（Prodh），羥脯氨酸脫氫酶（Prodh2），吡咯啉-5-羧酸還原酶1（Pycr1），吡咯啉-5-羧酸還原酶2（Pycr2），吡咯啉-5-羧酸還原酶3（Pycrl ）及δ-1-吡咯啉-5-羧酸合酶（ENSRNOG00000047305）（圖9）。

圖9 ALDH4A1蛋白-蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.10 ALDH4A1蛋白的同源性分析

用 UniProt 網(wǎng)站的 Blast 功能在線找到與褐家鼠ALDH4A1蛋白 氨基酸序列同源性較高的其他12種細(xì)菌，分別是小家鼠、黃金倉鼠、羊駝、小耳大嬰猴、北美灰熊、智人、馬鐵菊頭蝠、普通壁蜥、卡羅來納箱龜三趾亞種、綠頭鴨、青鳉和歐亞野豬。序列比對的結(jié)果顯示，ALDH4A1的氨基酸序列在動物之間保守性很高。與褐家鼠ALDH4A1序列一致性最高的是黃金倉鼠，高達(dá)91.7%；其次是小家鼠，序列一致性達(dá)91.5%；再次是小耳大嬰猴，序列一致性為90.2%；最低的是青鳉，為72.0%（圖 10）。

圖10 褐家鼠 與其他動物ALDH4A1蛋白多序列比對

2.11 ALDH4A1蛋白的進(jìn)化分析

基于氨基酸序列的同源性分析，使用MEGA7.0對包括褐家鼠在內(nèi)的13種動物的ALDH4A1蛋白進(jìn)行多序列比，對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖11）。研究顯示，與褐家鼠親緣關(guān)系最近的是小家鼠和黃金倉鼠，小家鼠與黃金倉鼠聚為一支后，與褐家鼠聚為一支，置信度為76；其次是馬鐵菊頭蝠，但二者的置信度較低，僅為35。此外，羊駝和歐亞野豬聚為一支，置信度為73；普通壁蜥和卡羅萊納箱龜三趾亞種聚為一支，但它們都與褐家鼠親緣性較低。

圖11 基于AL DH4A1的氨基酸序列構(gòu)建的褐家鼠與各動物系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

心血管病（Cardiovascular disease,CVD）死亡占我國城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，目前我國約有CVD患者人數(shù)約3.30 億[10]。CVD發(fā)病機(jī)制居高不下成為全球公共衛(wèi)生問題，有關(guān)CVD治療和預(yù)防機(jī)制尚不明確。該研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對ALDH4A1進(jìn)行了分析。序列比對的結(jié)果顯示，ALDH4A1的氨基酸序列在動物之間保守性較。ALDH4A1氨基酸序列分析顯示，性質(zhì)穩(wěn)定、堿性的親水蛋白。TMHMM預(yù)測結(jié)果顯示，ALDH4A1蛋白無跨膜螺旋區(qū)，不存在信號肽，且具有潛在的糖基化和磷酸化修飾位點(diǎn)，以及蛋白激酶的結(jié)合位點(diǎn)。

由ALDH4A1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果顯示，ALDH4A1蛋白主要以α-螺旋型結(jié)構(gòu)和無規(guī)則的卷曲為主。由此可知，在ALDH4A1分子中，α-螺旋型結(jié)構(gòu)利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無規(guī)則的卷曲結(jié)構(gòu)存在，可能與抗原表位的形成有關(guān)。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，ALDH4A1與Got1、Glul、Glud 1、Oat、Prodh、Pro dh2、等10個蛋白存在相互關(guān)系。研究表明，Got1[11]、Glul[12]等與炎癥反應(yīng)高度相關(guān)，Prodh[13,14]可作為基因治療CVD的潛在靶點(diǎn)。炎癥反應(yīng)是AS病理基礎(chǔ)[4,15]，在AS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要作用[7,16]，由此預(yù)測ALDH4A1與AS存在相互關(guān)系，進(jìn)一步研究證AS小鼠和人類體內(nèi)ALDH4A1表達(dá)水平顯著增加[9]。全面了解ALDH4A1 功能和機(jī)制有助于藥物設(shè)計，為AS治療提供靶向抗原，ALDH4A1也可以作為CVD潛在的治療方式之一。