羅亞燦，吳鎮(zhèn)杰，金敏莉，樓樂靜，楊松，蔡濟豪，蔡暢

1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，浙江 溫州 325015；2.臺州醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 臺州 317000

氣道重塑是哮喘的主要病理特征之一，是導致患者不可逆性肺功能下降的主要原因，與哮喘嚴重程度密切相關[1]。研究證實，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymaltransition, EMT）是氣道重塑的重要機制之一[2]。

脂氧素A4（lipoxinA4, LXA4）是重要的內(nèi)源性脂質介質[3]。臨床研究顯示，重度哮喘患者體液中LXA4水平明顯降低，并與肺功能下降程度存在正相關性[4]。LXA4可在體外抑制結締組織生長因子誘導的人肺成纖維細胞增殖[5]和膠原分泌[6]。15-epi-LXA4可以逆轉博來霉素引起的肺纖維化[7]。成纖維細胞和氣道上皮細胞等與氣道重塑改變相關的細胞均普遍表達LX受體[5，8]。小鼠體內(nèi)實驗證實LXA4可以同時減輕哮喘小鼠的過敏性氣道炎癥和氣道重塑[9]，而在體外細胞實驗中，上皮細胞中LX受體和LX的表達增加有助于受損氣道上皮的修復[8]。這些證據(jù)均提示LXA4在氣道重塑中發(fā)揮著重要作用。本研究探討LXA4對人正常支氣管上皮細胞EMT和卵清蛋白（ovalbumin, OVA）誘導的哮喘小鼠氣道重塑的影響以及相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料 BEAS-2B細胞株購自美國典型菌種保藏中心（AmericanTypeCultureCollection, ATCC）；6～8周齡BALB/c雄性小鼠32只，體質量18～22g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK（滬）2012-0002]，動物飼養(yǎng)在無特定病原體的條件下，室溫維持在21～23℃，濕度保持40%～60%，12h/12h自然光照交替。LXA4購自美國CaymanChemical公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；BCA試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；ERK1/2、pERK1/2 抗體購自美國CellSignalTechnology公司；GAPDH抗體購自美國Abcam公司；SYBRGreenreal-timePCRMasterMix、反轉錄PCR試劑盒購于日本Takara公司；所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組和處理：將小鼠隨機分成4組：對照組、OVA組、LXA4組和OVA+LXA4組，每組8只。OVA誘導建立哮喘小鼠模型：在第1天和第14天，給小鼠腹腔注射0.2mL含有20μgOVA和200μL1.36%氫氧化鋁的0.9%氯化鈉溶液以誘導過敏；從第24天開始，小鼠霧化吸入含2mg/mLOVA的0.9%氯化鈉溶液處理30min，持續(xù)3d（對照組和LXA4組小鼠予以等量的0.9%氯化鈉溶液）。OVA+LXA4組和LXA4組每次霧化處理前半小時尾靜脈注射100μg/kgLXA4，對照組、OVA組注射等量0.9%氯化鈉溶液。收集小鼠肺左葉，4%多聚甲醛浸泡固定，石蠟包埋切片。

1.2.2 HE和PAS染色：收集的小鼠肺組織石蠟包埋切片進行HE和PAS染色，觀察肺組織形態(tài)學變化。

1.2.3 細胞培養(yǎng)和分組：正常肺氣道上皮細胞BEAS-2B在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃，含5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中。BEAS-2B細胞為貼壁生長，細胞匯集至70%～80%時，按1:4傳代。細胞分為6組：對照組、IL-4組（20ng/mLIL-4）、IL-13組（20ng/mLIL-13）、TGF-β1組（20ng/mLTGF-β1）、IL-4/IL- 13/TGF-β1 聯(lián)合刺激組（IL-4、IL-13 和TGF-β1 各20ng/mL）、LXA4預處理組（在添加IL-4、IL-13和TGF-β1前用200ng/mLLXA4預處理30min）。Beas-2B傳代24h后更換為1%胎牛血清培養(yǎng)基，按上述分組予以不同處理，72h后收集細胞。

1.2.4 實時定量聚合酶鏈反應（r e a l-tim equantitativepolymerasechainreaction, RTqPCR）：根據(jù)試劑盒說明，使用RNAisoplus提取各組細胞總RNA，分光光度計測RNA濃度和純度。使用PrimeScriptTMRTMasterMix將RNA反轉錄成cDNA。使用SYBR?PremixExTaqTM通過實時PCR進行定量。相對轉錄水平通過2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析。引物序列見表1，RPLP0用作內(nèi)參。

表1 引物序列

1.2.5 Westernblot：從細胞中分離蛋白質，并用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。蛋白質樣品加載到10%SDS-PAGE凝膠上分離并轉移到PVDF膜上，膜用5.0%牛奶室溫封閉2h，然后與2%BSA稀釋的一抗4℃孵育過夜，抗體濃度分別為：兔抗E-cadherin抗體、兔抗ERK1/2抗體和兔抗pERK1/2抗體1:1000，兔抗α-SMA抗體1:5000，鼠抗GAPDH抗體1:500。PBST洗膜3 次后，將膜與相應二抗室溫下孵育1h。使用ECL試劑盒對條帶進行可視化，使用ImageJ軟件進行條帶灰度值定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 使用GraphPadPrism8.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有實驗數(shù)據(jù)均采用±s表示。各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法檢驗，方差不齊采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LXA4對OVA誘導的小鼠哮喘氣道重塑的作用 HE染色結果顯示：對照組、LXA4組小鼠的肺泡組織結構完整，無水腫，肺實質未見明顯炎性細胞浸潤；OVA組小鼠表現(xiàn)為明顯的肺泡間隔增厚甚至肺泡結構破壞、水腫，有大量炎性細胞浸潤，肺組織還可見出血。PAS染色顯示：對照組和LXA4組未見明顯氣道上皮杯狀細胞化生；OVA組支氣管上皮組織中存在PAS強陽性染色區(qū)域，提示杯狀細胞增生和黏液分泌增加。LXA4干預能明顯改善OVA誘導的肺泡結構破壞和黏液產(chǎn)生。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE和PAS染色圖

圖2 各組細胞形態(tài)改變

2.2 IL-4、IL-13對TGF-β1誘導氣道上皮細胞BEAS-2B發(fā)生EMT的作用 如圖2所示：與對照組相比，單獨使用IL-4 或IL-13 刺激的BEAS-2B細胞形態(tài)未見明顯改變，TGF-β1組細胞連接變得松散，細胞間隙增加，呈長梭形；IL-4/IL-13/TGF-β1聯(lián)合刺激后細胞形態(tài)較TGF-β1組梭狀更為明顯，細胞連接更松散，細胞間隙更寬。RT-qPCR和Westernblot結果顯示：與對照組相比，單獨使用IL-4 或IL-13 刺激時，BEAS-2B細胞α-SMA、E-cadherin的mRNA和蛋白表達均無明顯改變（P＞0.05）；TGF-β1組細胞E-cadherinmRNA和蛋白表達均顯著降低，α-SMAmRNA和蛋白表達明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；IL-4/IL-13/TGF-β1聯(lián)合刺激組較TGF-β1組兩種標志物的改變更為明顯（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3。2.3 IL-4、IL-13、TGF-β1對氣道上皮細胞中ERK1/2MAPK通路的影響 Westernblot結果顯示：與對照組相比，單獨使用IL-4、IL-13 后細胞ERK1/2 蛋白磷酸化水平未見明顯變化（P＞0.05），TGF-β1組ERK1/2 蛋白磷酸化水平升高（P＜0.01），IL-4/IL-13/TGF-β1聯(lián)合刺激后BEAS-2B細胞中pERK1/2表達較單獨使用TGF-β1增加更為明顯（P＜0.05）。見圖4。2.4 LXA4通過ERK1/2通路調控氣道上皮細胞Beas-2BEMT 與IL-4/IL-13/TGF-β1 聯(lián)合刺激組相比，LXA4預處理后細胞間隙明顯變窄，細胞形態(tài)恢復橢圓形，僅少數(shù)細胞表現(xiàn)為梭形（見圖5）。RT-qPCR和Westernblot結果顯示，LXA4能夠顯著抑制IL-4、IL-13和TGF-β1聯(lián)合刺激誘導的α-SMA和E-cadherinmRNA和蛋白質表達改變（P＜0.01，P＜0.001）；明顯下調IL-4、IL-13和TGF-β1聯(lián)合刺激誘導的細胞內(nèi)pERK1/2表達增加（P＜0.01）。見圖6。

3 討論

哮喘氣道重塑包括氣道上皮完整性破壞、上皮下纖維化、杯狀細胞增生、平滑肌增生肥大和血管增生[10]。本研究通過小鼠模型證實，LXA4能明顯改善OVA誘導的杯狀細胞化生、肺泡結構破壞、肺泡壁水腫以及肺間質炎性細胞浸潤等氣道改變，這與之前的研究[9]結果一致，但LXA4對參與氣道重塑的結構細胞的影響尚未明確。

圖3 各組細胞E-cadherin和α-SMAmRNA和蛋白表達水平的 比較

圖5 各組BEAS-2B細胞的形態(tài)

研究表明，氣道上皮細胞功能的完整性可能與氣道重塑密切相關，抑制哮喘小鼠氣道上皮異?；罨梢杂行Ь徑庀瓪獾姥装Y和氣道重塑[11]。氣道上皮細胞EMT是氣道重塑的重要機制之一。暴露于過敏原的小鼠氣道上皮細胞會發(fā)生EMT并分化成肌成纖維細胞，引起上皮下纖維化，進而導致氣道壁增厚[12]。E-cadherin是上皮細胞的重要標志物之一，其表達下降可能破壞細胞與細胞的連接，增加細胞對損傷的易感性[13]。E-cadherin水平下調、間質細胞標志物α-SMA水平上升被視為EMT的重要表現(xiàn)之一[14]。TGF-β1是公認的促纖維化細胞因子[15-16]，常被用作EMT誘導劑。ZUO等[17]將氣道上皮細胞暴露在TGF-β1后發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)發(fā)生變化，E-cadherin表達下降。本研究使用TGF-β1誘導BEAS-2B建立EMT模型，TGF-β1刺激BEAS-2B細胞72h，細胞形態(tài)發(fā)生改變，從緊密連接的橢圓形上皮細胞向連接松散的長梭形間質細胞轉變，同時，與對照組相比，TGF-β1處理后E-cadherin表達顯著降低，而α-SMA表達明顯升高。

環(huán)境中的過敏原容易透過損傷的上皮屏障，激活嗜酸性粒細胞、肥大細胞等多種炎癥細胞，導致Th1/Th2功能失衡。Th1/Th2失衡在哮喘氣道重塑中起重要作用。IL-4 和IL-13 是重要的具有代表性的Th2源性細胞因子，能作用于氣道上皮，誘導杯狀細胞化生和黏液分泌，參與哮喘氣道上皮重塑[18-19]。本研究結果顯示，IL-4和IL-13 能顯著增強TGF-β1誘導的EMT形態(tài)改變，抑制E-cadherin表達和誘導α-SMA表達的效力。以上結果可能提示Th2細胞因子失衡的氣道微環(huán)境能促進TGF-β1誘導上皮細胞的EMT過程。

ERK1/2磷酸化可激活各種轉錄因子，調節(jié)細胞增殖、分化和凋亡。給予慢性哮喘大鼠ERK1/2 的激動劑能促進小鼠體內(nèi)氣道平滑肌細胞增殖[20]。ERK信號通路參與介導IL-13誘導的人支氣管上皮細胞杯狀細胞增生[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在IL-4/IL-13/TGF-β1聯(lián)合刺激誘導氣道上皮細胞BEAS-2B發(fā)生EMT時，細胞內(nèi)pERK1/2蛋白表達增加。之前在胰腺[22]、腎小管上皮細胞[23]、肝臟[24]等的研究也顯示組織器官發(fā)生EMT時ERK1/2MAPK磷酸化激活增加。因此我們推測，ERK1/2MAPK信號的激活可能同樣參與調控氣道上皮細胞EMT。

本課題組前期研究證實，LX與哮喘緩解密切相關[25-26]。研究表明：LXA4通過抑制子宮內(nèi)膜EMT來干擾胚胎植入[27]。LXA4的類似物BML-111能減緩肝癌細胞的EMT和轉移[28]。LXA4可以通過抑制ERK1/2MAPK通路的激活顯著減輕腎臟的損傷[29]、減弱胰腺癌的細胞侵襲[30]。在本研究中，LXA4能顯著抑制IL-4/IL-13/TGF-β1聯(lián)合刺激誘導的氣道上皮細胞E-cadherin表達下降和α-SMA表達增加，同時，LXA4預處理組與IL-4/IL-13/TGF-β1 聯(lián)合刺激組相比，pERK1/2MAPK蛋白表達下降，說明LXA4能在一定程度上抑制氣道上皮細胞EMT，而這種作用可能與ERK1/2磷酸化相關。

綜上所述，本研究以氣道上皮細胞為切入點，用IL-4 及IL-13 模擬重癥哮喘患者氣道上皮細胞所處的Th2細胞因子失衡的內(nèi)環(huán)境，發(fā)現(xiàn)Th2偏轉氣道微環(huán)境能促進TGF-β1誘導的氣道上皮細胞EMT；同時還發(fā)現(xiàn)LXA4能改善OVA誘導的哮喘小鼠模型的氣道重塑，并能在體外減輕氣道上皮細胞的EMT，這一過程可能與抑制ERK1/2MAPK通路磷酸化相關。