程繼 高丹 付國(guó) 董青川

(陜西省人民醫(yī)院泌尿外科， 陜西 西安 710068)

前列腺癌(Prostate cancer)是常見的惡性腫瘤，手術(shù)切除、放療和化療是目前常用的臨床治療手段[1-2]。但常規(guī)化療藥物和放射治療引起的副作用，嚴(yán)重影響了患者術(shù)后的康復(fù)和生活質(zhì)量[3-5]。研究前列腺癌的病理學(xué)進(jìn)程，不斷探尋其發(fā)病的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療手段，是目前臨床急需解決的問(wèn)題。姜黃素(Curcumin)是一種多酚類物質(zhì)，提取于姜黃、郁金等姜科植物中[6]。國(guó)內(nèi)外的研究均已證實(shí)[7-8]，姜黃素具有抗氧化、抗炎等作用，同時(shí)還有抑制腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。但姜黃素對(duì)前列腺癌生物學(xué)行為的影響，以及參與上述調(diào)控進(jìn)程的相關(guān)信號(hào)通路分子，目前依然不完善，需要進(jìn)一步的體內(nèi)外研究來(lái)證實(shí)。Notch1分子與前列腺癌的增殖密切相關(guān)，可以通過(guò)其下游的PI3K-AKT-mTOR和MEK-ERK途徑，分別影響腫瘤血管生成和體外生長(zhǎng)的過(guò)程[9]。但是否姜黃素通過(guò)影響Notch1分子，調(diào)控前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，目前相關(guān)報(bào)道鮮少，仍有待進(jìn)一步的研究。 本實(shí)驗(yàn)以人前列腺癌PC-3細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)給予不同濃度的姜黃素處理，觀察前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的變化，同時(shí)分析姜黃素對(duì)Notch1分子表達(dá)水平的影響，觀察是否姜黃素影響前列腺癌PC-3細(xì)胞體外生長(zhǎng)，進(jìn)一步闡明姜黃素抑制前列腺癌生長(zhǎng)的分子機(jī)制，為臨床前列腺癌的化療提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌PC-3細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。姜黃素(Curcumin)購(gòu)于 Sigma公司。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購(gòu)于Invitrogen公司。人前列腺癌PC-3細(xì)胞，參考文獻(xiàn)常規(guī)培養(yǎng)，37℃孵箱，95%O2和5%CO2，DMEM培養(yǎng)液包括10%滅活血清。

1.2 對(duì)細(xì)胞增殖的影響 常規(guī)培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，密度為5×103/孔，給予不同濃度的姜黃素處理(溶于DMSO)，分別為500 nmol/L組、10 μmol/L組、100 μmol/L組和空白對(duì)照組(給予DMSO處理)。收集細(xì)胞，通過(guò)MTT法觀察姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響。PCNA mRNA可反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖水平，收集上述細(xì)胞，提取RNA，通過(guò)定量PCR法檢測(cè)PCNA mRNA水平的變化，觀察不同濃度姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞中PCNA mRNA的影響，分析各組間差異。

1.3 細(xì)胞凋亡的變化 收集不同處理組的細(xì)胞，與Annexin V/PI溶液室溫孵育30 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理組PC-3細(xì)胞凋亡率的變化，觀察不同濃度姜黃素處理3 d后，對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡率的影響。Bcl-2分子mRNA水平可反應(yīng)腫瘤細(xì)胞凋亡狀態(tài)，收集上述細(xì)胞，提取RNA，通過(guò)定量PCR法，檢測(cè)Bcl-2 mRNA水平的變化，觀察不同濃度姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞中Bcl-2 mRNA水平的影響，分析各組間差異。

1.4 Caspase活性檢測(cè) 收集不同處理組的細(xì)胞，按Caspase活性檢測(cè)試劑盒操作規(guī)范要求，處理細(xì)胞，離心20 min，2000轉(zhuǎn)/min，上清孵育60 min，測(cè)定各組樣品吸光度的變化，分析PC-3細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9活性的變化，觀察不同濃度姜黃素處理3 d后，對(duì)PC-3細(xì)胞中Caspase活性的影響。

1.5 分析Notch1和PI3K的變化 PC-3細(xì)胞經(jīng)不同濃度姜黃素處理3 d后，收集上述經(jīng)過(guò)姜黃素處理的細(xì)胞，提取RNA，通過(guò)定量PCR法，檢測(cè)PC-3細(xì)胞中Notch1和PI3K mRNA水平變化，分析各組間差異；同時(shí)，PC-3細(xì)胞經(jīng)不同濃度姜黃素處理3 d后，收集上述各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，通過(guò)蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)PC-3細(xì)胞中Notch1和PI3K蛋白表達(dá)的變化。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響 500 nmol/L組、10 μmol/L組和100 μmol/L組其存活率均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)；而與500 nmol/L組比較，10 μmol/L組和100 μmol/L組對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示姜黃素影響PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)具有一定的劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，姜黃素抑制PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)具有一定時(shí)間依賴性，PC-3細(xì)胞經(jīng)低劑量姜黃素處理3 d后，細(xì)胞增殖水平受到顯著抑制。500 nmol/L組其PCNA mRNA水平降低，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10 μmol/L組和100 μmol/L組中PCNA mRNA水平顯著低于500 nmol/L組(P<0.05)，提示姜黃素降低PCNA mRNA水平，抑制PC-3細(xì)胞增殖，并體現(xiàn)一定的劑量依賴性。見表1、圖1。

表1 姜黃素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of Curcumin on PC-3 cell proliferation

2.2 姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡率的影響 500 nmol/L組凋亡率高于空白對(duì)照組(P<0.05)；與500 nmol/L組比較，10 μmol/L組、100 μmol/L組對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡率的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示姜黃素影響PC-3細(xì)胞凋亡率的效應(yīng)具有一定的劑量依賴性。PC-3細(xì)胞中Bcl-2 mRNA水平較高，500 nmol/L組Bcl-2 mRNA水平降低，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10 μmol/L組和100 μmol/L組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA水平顯著低于500 nmol/L組(P<0.05)，提示姜黃素降低Bcl-2 mRNA水平，誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡，并體現(xiàn)一定的劑量依賴性。見表2、圖2。

表2 姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡率的影響Table 2 Effect of Curcumin on PC-3 cell apoptosis

2.3 姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞中Caspase活性的影響 500 nmol/L組Caspase-3和Caspase-9活性高于空白對(duì)照組(P<0.05)。同時(shí)，姜黃素對(duì)Caspase-3和Caspase-9活性的影響，也體現(xiàn)一定的劑量依賴性，10 μmol/L組和100 μmol/L組PC-3細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9活性顯著高于500 nmol/L組(P<0.05)。見圖3、圖4。

2.4 姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞中Notch1水平的影響 PI3K-AkT-mTOR是Nototh1分子下游信號(hào)途徑，Notch1通過(guò)上述途徑調(diào)控腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)狀態(tài)。500 nmol/L組Notch1和PI3K 蛋白表達(dá)降低，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10 μmol/L組和100 μmol/L組PC-3細(xì)胞中Notch1和PI3K蛋白表達(dá)顯著低于500 nmol/L組(P<0.05)，提示姜黃素可抑制Notch1和PI3K蛋白表達(dá)，并體現(xiàn)一定的劑量依賴性。PC-3細(xì)胞中Notch1和PI3K mRNA水平較高，500 nmol/L組Notch1和PI3K mRNA水平降低，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10 μmol/L組和100 μmol/L組PC-3細(xì)胞中Notch1和PI3K mRNA水平顯著低于500 nmol/L組(P<0.05)，提示姜黃素可抑制Notch1 和PI3K mRNA的水平，并體現(xiàn)一定的劑量依賴性；此外，姜黃素通過(guò)Notch1途徑調(diào)控PI3K mRNA水平，影響PC-3細(xì)胞體外生長(zhǎng)。見圖5、圖6、圖7。

3 討論

姜黃素作為一種傳統(tǒng)的植物藥物，已在中國(guó)和印度有超過(guò)2000年的應(yīng)用歷史。在多種慢性疾病的治療中，姜黃素已被證實(shí)具有重要的藥理效應(yīng)，包括炎癥，風(fēng)濕，代謝紊亂，肝臟疾病，肥胖，神經(jīng)退行性疾病和一些惡性腫瘤[10-12]。截止2018年，在國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的姜黃素有關(guān)的研究論文中(來(lái)源于pubmed檢索)，37% 的文章都是與腫瘤相關(guān)的研究[13]。腫瘤是目前發(fā)達(dá)國(guó)家位居第一位的死亡因素，盡管近年來(lái)早期診斷和多種治療措施的應(yīng)用，有效降低了腫瘤引起的死亡率，但腫瘤耐藥性等因素依然是目前面臨的巨大難題，嚴(yán)重影響了臨床的治療效果。研究已發(fā)現(xiàn)，姜黃素自身具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用姜黃素，還可以顯著提高其他抗腫瘤手段的臨床治療效果，通過(guò)影響不同的信號(hào)通路，增加放療敏感性或化療敏感性[14-16]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明[17]，姜黃素可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。此外，研究[18]還發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠影響血管的生成，從而可以調(diào)控腫瘤血管生成的過(guò)程。據(jù)報(bào)道，姜黃素可調(diào)控p53、NF-kB、MAPK、Nrf2等信號(hào)通路，影響結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、口腔癌等惡性腫瘤的病理進(jìn)程。姜黃素可以顯著降低IkB 激酶的磷酸化水平，阻止NF-kB亞單位p65的核轉(zhuǎn)錄作用，減少IL-6和IL-11等細(xì)胞因子的分泌，抑制NF-kB活性，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，增殖等過(guò)程。前列腺癌是常見的惡性腫瘤，研究前列腺癌的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療手段，提高臨床療效，減輕常規(guī)化療藥物和放射治療引起的副作用，對(duì)于改善患者生存質(zhì)量，具有重要的臨床意義。

研究[19-20]證實(shí)，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，Notch信號(hào)通路參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程，相關(guān)的分子在上述通路中扮演著重要的作用。Notch受體是以異源二聚體形式存在的膜蛋白分子[21]。研究[22]還發(fā)現(xiàn)，Notch1分子在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增高，針對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等，Notch分子均參與調(diào)控上述過(guò)程。在淋巴瘤的發(fā)展進(jìn)程中，Myc可以與Notch1相互協(xié)同，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的體外增殖，這一過(guò)程與MAML突變有關(guān)。此外，PI3K-AKT-mTOR 和MEK-ERK途徑與Notch1分子的表達(dá)水平密切相關(guān)，影響腫瘤的生長(zhǎng)。PI3K-AKT-mTOR是Notch1分子下游信號(hào)途徑，Notch1通過(guò)上述途徑調(diào)控腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)狀態(tài)。因此，尋找與Notch1分子作用相關(guān)的多酚類物質(zhì)，有望影響腫瘤細(xì)胞的體外增殖等過(guò)程，具有一定的臨床意義。但是否姜黃素可以影響前列腺癌細(xì)胞中Notch1分子的水平，調(diào)控前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，目前尚未見相關(guān)報(bào)道，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量的姜黃素可以抑制PC-3細(xì)胞的增殖，并具有一定的劑量依賴性。此外，姜黃素可以誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡的發(fā)生，顯著增加PC-3細(xì)胞凋亡率，這一效應(yīng)可能與Caspase活性有關(guān)。經(jīng)過(guò)姜黃素處理的PC-3細(xì)胞，其Caspase-3和Caspase-9活性顯著增加。我們的結(jié)果還證實(shí)，PC-3細(xì)胞中Notch1 和PI3K mRNA高表達(dá)。PC-3細(xì)胞中Notch1和PI3K mRNA水平較高，經(jīng)過(guò)姜黃素處理的PC-3細(xì)胞，可顯著降低Notch1 和PI3K mRNA水平和蛋白表達(dá)，體現(xiàn)一定的劑量依賴性。提示，姜黃素可能通過(guò)對(duì)Notch1分子的抑制效應(yīng)，調(diào)控PI3K水平，影響前列腺癌細(xì)胞的體外生物學(xué)特點(diǎn)，但具體的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，姜黃素可以影響前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程，可能為臨床前列腺癌的化療提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。