饒琦 王丹丹 羅婷 趙佳莉 趙寅

(四川大學華西醫(yī)院血液科·四川大學華西護理學院，四川 成都 610041)

多發(fā)性骨髓瘤是起源于B細胞的一種致命性腫瘤，約占所有血液惡性腫瘤的10%[1]。隨著治療方案的改進和自體干細胞移植清髓化療的使用，多發(fā)性骨髓瘤患者的治療取得巨大進步，但其在很大程度上仍無法治愈[2]，并且多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制仍有待闡明。長鏈非編碼RNA (Long noncoding RNA，lncRNA)PITPNA反義RNA 1(PITPNA antisense RNA 1，PITPNA-AS1)是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在乳頭狀甲狀腺癌[3]、非小細胞肺癌[4]和結(jié)直腸癌[5]中高表達，通過海綿不同的微小RNA (MicroRNA，miRNA)起著致癌因子的作用加速腫瘤進展。但lncRNA PITPNA-AS1在多發(fā)性骨髓瘤中的功能有待探索。最近的證據(jù)表明，miRNA參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展[6]。miR-367-3p作為抑癌因子，涉及多種腫瘤的病理過程，例如宮頸癌組織和細胞系中miR-367-3p低表達，miR-367-3p過表達抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲[7]。上調(diào)的miR-367-3p使肺癌的增殖和遷移能力減弱[8]。但是，miR-367-3p是否調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤的生長和轉(zhuǎn)移仍是未知的。因此，本研究探討lncRNA PITPNA-AS1在多發(fā)性骨髓瘤中的表達情況及其對多發(fā)性骨髓瘤對細胞增殖、遷移和侵襲行為的影響，分析其潛在機制，以期為多發(fā)性骨髓瘤的分子療法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 多發(fā)性骨髓瘤細胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2(美國型培養(yǎng)物保藏中心)；小鼠成骨細胞系MC3T3-E1(無錫欣潤)；siRNA-lncRNA PITPNA-AS1(si-lncRNA PITPNA-AS1)、siRNA NC (si-NC)、pcDNA、pcDNA-lncRNA PITPNA-AS1、miR-367-3p mimics、miR-367-3p inhibitors (anti-miR-367-3p)、mimics/inhibitors NC (miR-NC/anti-miR-NC)(上海GenePharma)；細胞計數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、雙熒光素酶試劑盒(上海Yeasen)；蛋白質(zhì)提取試劑盒(北京Solarbio)；基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloprotease，MMP)2兔多克隆抗體、MMP9兔多克隆抗體、二抗(美國Abcam)；螢光素酶報告載體pGL3、AMV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(美國Promega)；SYBR Green Real Time PCR Master Mix試劑盒(德國Roche)。

1.2 細胞培養(yǎng) 將RPMI-8226、MM1. S、OPM-2、MC3T3-E1細胞保存在Roswell Park Memorial Institute 1640培養(yǎng)基(RPMI1640)中，并混合有10%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素。MC3T3-E1細胞用混合有10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基。所有細胞均在5% CO2、濕潤培養(yǎng)箱中于37℃孵育。

1.3 定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR) TRIzol試劑用于從成骨細胞MC3T3-E1、多發(fā)性骨髓瘤細胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中提取RNA。采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用SYBR Green Real Time PCR Master Mix試劑盒在ABI 7900 Real-Time PCR中進行qRT-PCR。以GAPDH和U6為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt方法估算lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p表達。引物序列：GAPDH 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′(Forward)，5′-AGGGGCCATC CACAGTCTTC-3′(Reverse)；U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(Forward)，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(Reverse)；lncRNA PITPNA-AS1 5′-GCAGGGTGGATAAAGAGGA-3′(Forward)，5′-CCTACTGACAGGATGTCCT-3′(Reverse)；miR-367-3p 5′-GCAGAATTGCACTTTAGCAATG-3′(Forward)，5′-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCAC-3′(Reverse)。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染與分組 將多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226以1×105細胞/孔接種到6孔板，培養(yǎng)至70%～80%純度，使用Lipofectamine 2000，在RPMI-8226細胞中轉(zhuǎn)染si-NC (si-NC組)、si-lncRNA PITPNA-AS1(si-lncRNA PITPNA-AS1組)、miR-NC (miR-NC組)、miR-367-3p mimics (miR-367-3p組)，或同時轉(zhuǎn)染anti-miR-NC與si-lncRNA PITPNA-AS1(anti-miR-NC+si-lncRNA PITPNA-AS1組)、anti-miR-367-3p與si-lncRNA PITPNA-AS1(anti-miR-367-3p+si-lncRNA PITPNA-AS1組)，并將未轉(zhuǎn)染的細胞設為對照組(NC組)。48 h后利用qRT-PCR檢測RPMI-8226細胞的轉(zhuǎn)染情況，并進行后續(xù)測定。

1.5 Western Blot 使用蛋白質(zhì)提取試劑盒對RPMI-8226細胞進行蛋白質(zhì)分離。將30 μg蛋白質(zhì)樣品上樣到12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在脫脂奶中封閉，然后與抗MMP2(1：2 000稀釋度)、MMP9(1：2 000稀釋度)的特異性一抗一起孵育，然后在辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1：5 000稀釋)中進行探測。使用化學發(fā)光試劑對蛋白條帶進行可視化和分析。

1.6 CCK-8實驗 將RPMI-8226細胞以5×103/孔接種在96孔板中，48 h后引入10 μL CCK-8試劑，將細胞在37℃下再保持1 h。使用Biotech酶標儀記錄每個孔在450 nm處的吸光度A值，細胞活力與A值成正比。

1.7 細胞克隆形成實驗 將RPMI-8226細胞以300細胞/孔接種在6孔板中。常規(guī)培養(yǎng)2周后，將克隆的細胞(>50細胞)用甲醇固定，并用0.1%結(jié)晶紫染色，然后在顯微鏡下計數(shù)。

1.8 Transwell實驗 RPMI-8226細胞的侵襲和遷移能力通過Transwell測定法進行評估。為了檢測侵襲能力，將無血清培養(yǎng)基中的4×104個RPMI-8226細胞接種到涂有Matrigel的上室中。為了進行遷移能力檢測，將無血清培養(yǎng)基中的1×104細胞接種到上室中。Transwell下室填充10% FBS的培養(yǎng)基。孵育后24 h，將遷移或侵襲性細胞用0.1%的結(jié)晶紫染色，并在光學顯微鏡下計數(shù)。

1.9 雙熒光素酶活性檢測 用starbase預測lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的結(jié)合區(qū)域。將相應的含有miR-367-3p結(jié)合位點的lncRNA PITPNA-AS1-野生型(WT)及突變型(MUT)序列插入螢光素酶報告載體pGL3，以構建lncRNA PITPNA-AS1-WT及MUT報告基因載體。在多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226中同時轉(zhuǎn)染miR-367-3p mimics或miR-NC和lncRNA PITPNA-AS1-WT及MUT報告基因載體。36 h后利用雙熒光素酶試劑盒評估相對熒光素酶活性。另將pcDNA、pcDNA-lncRNA PITPNA-AS1、si-NC、si-lncRNA PITPNA-AS1轉(zhuǎn)染到RPMI-8226細胞中，48 h通過qRT-PCR測定lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 在多發(fā)性骨髓瘤細胞系中l(wèi)ncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的表達情況 與成骨細胞MC3T3-E1比較，多發(fā)性骨髓瘤細胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中l(wèi)ncRNA PITPNA-AS1表達量均增加，miR-367-3p的表達量均減少(P<0.05)。將差異最顯著的RPMI-8226細胞用作后續(xù)研究對象。見表1。

表1 在多發(fā)性骨髓瘤細胞系中，lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的表達情況

2.2 干擾lncRNA PITPNA-AS1抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲 在多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226中轉(zhuǎn)染si-lncRNA PITPNA-AS1來干擾lncRNA PITPNA-AS1，si-lncRNA PITPNA-AS1組較NC組減少lncRNA PITPNA-AS1、MMP2蛋白和MMP9蛋白的表達量，并降低細胞活力、克隆形式數(shù)、遷移和侵襲數(shù)量(均P<0.05)，而si-NC組較NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、圖1。

表2 干擾lncRNA PITPNA-AS1抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲Table 2 Interfering with lncRNA PITPNA-AS1 inhibits the proliferation，migration and invasion of multiple myeloma cells RPMI-8226

2.3 miR-367-3p高表達抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲 在多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226中轉(zhuǎn)染miR-367-3p mimics，miR-367-3p組miR-367-3p表達量比miR-NC組高，MMP2蛋白、MMP9蛋白的表達量、細胞活力、克隆形式數(shù)、遷移和侵襲數(shù)量均比miR-NC組低(均P<0.05)，見表3、圖2。

表3 miR-367-3p高表達抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲Table 3 High expression of miR-367-3p inhibits the proliferation，migration and invasion of multiple myeloma cells RPMI-8226

2.4 lncRNA PITPNA-AS1靶向調(diào)控miR-367-3p的表達 在starbase中預測miR-367-3p和lncRNA PITPNA-AS1的靶向結(jié)合(見圖3)。miR-367-3p組lncRNA PITPNA-AS1-WT相對熒光素酶活性比miR-NC組減少了0.53倍(P<0.05)，但miR-367-3p組與miR-NC組lncRNA PITPNA-AS1-MUT相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表4)。pcDNA-lncRNA PITPNA-AS1組多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226中l(wèi)ncRNA PITPNA-AS1表達量比pcDNA組高，miR-367-3p表達量比pcDNA組低(均P<0.05)；si-lncRNA PITPNA-AS1組lncRNA PITPNA-AS1表達量比si-NC組低，miR-367-3p表達量比si-NC組高(均P<0.05)，見表5。

表4 miR-NC或miR-367-3p mimics與lncRNA PITPNA-AS1-野生型(WT)及突變型(MUT)報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226后雙熒光素酶活性檢測

表5 qRT-PCR檢測miR-367-3p的表達Table 5 The expression of miR-367-3p detected by qRT-PCR

2.5 anti-miR-367-3p可以逆轉(zhuǎn)si-lncRNA PITPNA-AS1對多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲的影響 在多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226細胞中同時轉(zhuǎn)染anti-miR-367-3p和si-lncRNA PITPNA-AS，anti-miR-367-3p+si-lncRNA PITPNA-AS組miR-367-3p表達量低于anti-miR-NC+si-lncRNA

PITPNA-AS1組，MMP2蛋白、MMP9蛋白的表達量、細胞活力、克隆形式數(shù)、遷移和侵襲數(shù)量均高于anti-miR-NC+si-lncRNA PITPNA-AS1組(均P<0.05)，見圖4、表6。

表6 Anti-miR-367-3p可以逆轉(zhuǎn)si-lncRNA PITPNA-AS1對多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲的影響

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，lncRNA分子的表達與許多腫瘤的發(fā)展和進展有關，lncRNA介導的生物學是癌癥進展的重要關鍵途徑[9-11]。由于lncRNA參與增殖、凋亡、代謝和分化，它們在包括多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的許多疾病的生物學過程和發(fā)病機理中起著關鍵作用[12]。lncRNA PITPNA-AS1定位于染色體17p13.3，顯示出對腫瘤生長的促進作用。Sun等[13]在肝細胞癌組織中觀察到lncRNA PITPNA-AS1升高，其在體外通過靶向miR-876-5p具有促進肝細胞癌的生長和轉(zhuǎn)移的致癌作用。Guo等[14]發(fā)現(xiàn)人宮頸癌組織和細胞系中l(wèi)ncRNA PITPNA-AS1顯著增加，其過表達促進宮頸癌細胞增殖，而lncRNA PITPNA-AS1敲除抑制細胞增殖，并且lncRNA PITPNA-AS1的調(diào)控作用與海綿miR-876-5p有關。另一項研究表明，lncRNA PITPNA-AS1在肺鱗癌樣本中高度表達，其缺失阻礙了肺鱗癌細胞的增殖和遷移能力[17]。然而lncRNA PITPNA-AS1在多發(fā)性骨髓瘤中的作用仍然未知。與前述研究相類似，本研究發(fā)現(xiàn)干擾lncRNA PITPNA-AS1可抑制骨髓瘤細胞RPMI-8226的增殖、遷移和侵襲。因此，確定lncRNA PITPNA-AS1在多發(fā)性骨髓瘤中同樣起到腫瘤促進劑的作用。

本研究還探討了lncRNA PITPNA-AS1在多發(fā)性骨髓瘤中的潛在機制，雙熒光素酶報告測定和qRT-PCR實驗證實miR-367-3p是lncRNA PITPNA-AS1的靶標之一。一項研究[16]表明，miR-367-3p是化療前、化療中和化療后轉(zhuǎn)移性睪丸生殖細胞癌的血清生物標志物。miR-367-3p在膠質(zhì)瘤組織和細胞系中下調(diào)，作為腫瘤抑制因子，阻礙膠質(zhì)瘤細胞的惡性增殖、遷移和侵襲[17-18]。Raikundalia等[19]在乳腺癌MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染miR-367-3p，發(fā)現(xiàn)細胞表現(xiàn)出較高水平的凋亡和較低的細胞遷移。子宮內(nèi)膜癌組織中的miR-367-3p顯著下調(diào)，通過抑制HMGA2的表達來抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的惡性行為[20]。然而關于miR-367-3p在多發(fā)性骨髓瘤中的研究報道鮮少。本研究發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤細胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中miR-367-3p的表達降低，還證實miR-367-3p高表達能抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，表明miR-367-3p是多發(fā)性骨髓瘤的抑癌基因。lncRNA通常作為miRNA海綿來調(diào)節(jié)各種癌癥的進展[21-23]。如lncRNA PITPNA-AS1通過海綿miR-129-5p促進甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和遷移，抑制細胞凋亡[3]。lncRNA PITPNA-AS1沉默通過靶向miR-32-5p抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]。lncRNA OIP5-AS1在胃癌細胞中作為miR-367-3p的內(nèi)源性海綿發(fā)揮致癌作用[24]。本研究中，miR-367-3p被鑒定為lncRNA PITPNA-AS1的靶miRNA，lncRNA PITPNA-AS1直接負向調(diào)控miR-367-3p的表達。此外，干擾lncRNA PITPNA-AS1對多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226增殖、遷移和侵襲的抑制作用可被anti-miR-367-3p逆轉(zhuǎn)。這表明lncRNA PITPNA-AS1通過在多發(fā)性骨髓瘤中海綿miR-367-3p來發(fā)揮其致癌作用。

4 結(jié)論

在多發(fā)性骨髓瘤細胞中l(wèi)ncRNA PITPNA-AS1水平上調(diào)，而lncRNA PITPNA-AS1通過調(diào)節(jié)miR-367-3p抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。lncRNA PITPNA-AS1/miR-367-3p調(diào)節(jié)網(wǎng)絡為多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展提供了新視角，而lncRNA PITPNA-AS1可能是多發(fā)性骨髓瘤的關鍵治療和診斷目標。