孫博蕊 孫杰瑜 李志鵬 蘇志強(qiáng)

(1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)室，遼寧 沈陽(yáng) 110000；2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110000；3. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 沈陽(yáng) 110000；4. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150000)

顱腦外傷(Traumatic brain injury，TBI)是由外力作用引起的正常大腦功能損傷，主要由跌倒、暴力和交通事故等造成，是45歲以內(nèi)成人致殘和死亡率高的首要原因[1]。盡管大多數(shù)神經(jīng)損傷是有限和暫時(shí)性的，TBI仍留有多種后遺癥，包括睡眠障礙、垂體功能減退、癲癇以及神經(jīng)退行性疾病[2]。事實(shí)上，TBI被廣泛認(rèn)為是神經(jīng)退行性疾病的危險(xiǎn)因素，其特征為神經(jīng)元或髓鞘緩慢進(jìn)行性喪失和殘疾增加(如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病和多發(fā)性硬化癥等)，值得注意的是，不同類型TBI患者患神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)往往會(huì)增加[3]。苷草是一種多年生草本豆科植物，以根或根莖入藥，富含甘草苷、三萜皂苷、異甘草素(Isoliquiritigenin，ISL)等多種有效成分[4]。ISL提取自甘草根部，是一種具有查爾酮結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物[5]，具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等藥理活性，且能擴(kuò)張動(dòng)脈，起到保護(hù)心臟和大腦作用[6]。研究表明，ISL能降低糖尿病神經(jīng)病變大鼠氧化損傷，并可降低核轉(zhuǎn)錄因子-κB (Nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB)活性發(fā)揮對(duì)膿毒癥小鼠腦損傷的保護(hù)作用[7]。此外，ISL可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激降低缺血再灌注所致的損傷[8]。本研究通過(guò)建立TBI模型，初步探討ISL對(duì)TBI大鼠的影響，為ISL相關(guān)藥物研發(fā)及臨床治療TBI提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取60只SPF級(jí)雄性健康大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，8周齡，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可：SCXK (滬)2018-0004，購(gòu)入后保持室內(nèi)溫度(24±1)℃，空氣相對(duì)濕度(60±10)%，光照晝夜交替循環(huán)12 h，室溫下飼養(yǎng)1周。本研究通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 異甘草素，純度98%，北京solarbio科技有限公司；甘油果糖氯化鈉注射液，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20055446，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司；IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-αELISA試劑盒，美國(guó)Sigma公司；蛋白BCA試劑盒，美國(guó)R&D公司；兔抗Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)TLR4單抗、髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)單抗、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(Nuclear transcription factor-kappa B p65，NF-κB p65)單抗、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(P-hosphorylated nuclear transcription factor-kappa B p65，p-NF-κB p65)單抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單抗，羊抗兔二抗-HRP，英國(guó)Abcam公司；重錘擊打裝置，徐州電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；電泳儀、垂直電泳槽，美國(guó)Satan Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 建模和分組 隨機(jī)選取50只大鼠術(shù)前禁食禁水8 h，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)麻醉，待麻醉生效后，將大鼠俯臥并固定于腦立體定向儀，剃除術(shù)區(qū)毛發(fā)、消毒，無(wú)菌環(huán)境下沿中線矢狀位切開(kāi)頭部，剝離骨膜，暴露中線顱頂骨，采用牙科鉆在冠狀縫后、中線旁區(qū)域鉆打骨窗(直徑5 mm左右，且硬膜完整)，使用重錘擊打裝置進(jìn)行擊打，選擇40 g的圓柱形擊錘，高度為20 cm，自由落體擊打骨窗，致使大鼠顱腦損傷，撞擊后在大鼠腦部切口處滴入硫酸慶大霉素(40000 U，4～5滴)預(yù)防傷口感染，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮后放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)(25℃恒溫)，并自由進(jìn)食水。當(dāng)大鼠呼吸出現(xiàn)數(shù)秒暫停、四肢抽搐、且麻醉失效后無(wú)偏癱等現(xiàn)象，即為造模成功[9]。取建模成功后40只大鼠(6只死亡，4只無(wú)任何癥狀)隨機(jī)分為模型組、ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽(yáng)性藥物組，每組10只；另取10只大鼠作為對(duì)照組，不進(jìn)行任何擊打處理。

1.2.2 干預(yù)方法 建模成功后24 h，參照文獻(xiàn)[4]用量，ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽(yáng)性藥物組分別給予20 mg·kg-1、40 mg·kg-1異甘草素溶液及20 mg·kg-1甘油果糖氯化鈉注射液120 μL，給予對(duì)照組與模型組等量生理鹽水，1次/d，共計(jì)6周。

1.2.3 標(biāo)本采集 末次給藥后24 h，抽取大鼠腹部主動(dòng)脈血，離心取血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｌ幩来笫?，無(wú)菌剝離腦組織，一部分置于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定備用，余下-80℃存儲(chǔ)備用。

1.2.4 血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α含量測(cè)定 取-20℃保存?zhèn)溆醚?，離心取上清(5000 r·min-1，10 min，離心半徑20 cm)，ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α含量。抗體包被過(guò)夜(100 μL，37°C，60 min)、洗滌，加待測(cè)樣品(100 μL，37℃，60 min)、洗滌，加入酶標(biāo)抗體(0.1 mL，37℃，1 h)、洗滌，加底物液避光顯色(90 μL，37℃，15 min)，添加終止液停止反應(yīng)(50 μL)，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α含量。

1.2.5 腦組織病理學(xué)變化觀察 取4多聚甲醛固定備用腦組織，石蠟包埋，切片4 μm，65℃加熱30 min，脫蠟20 min，蘇木精染色3～5 min、清洗、體積分?jǐn)?shù)1% H2O2浸泡10～30 s，水洗、伊紅染色20 min，水洗，酒精脫水10 min，二甲苯透化10 min，中性樹(shù)脂封固，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.6 腦組織TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA檢測(cè) 取-80℃存儲(chǔ)備用1/2腦組織，勻漿，Trizol法提取RNA，測(cè)定純度、濃度，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：1.5 μL Taq聚合酶、1 μL上下游引物、4 μL模板cDNA、13.5 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：預(yù)變性(95℃，30 s)、變性(95℃，5 s)、退火(59℃，30 s)，共40個(gè)循環(huán)，加熔解曲線，降溫(50℃，30 s)。以GAPDH作為內(nèi)源對(duì)照，數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法，重復(fù)多次，取Ct均值。引物序列，見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.2.7 腦組織TLR4、My D88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白檢測(cè) 取-80℃存儲(chǔ)備用1/2腦組織，加RIPA裂解緩沖液，離心(6000 r·min-1，10 min，離心半徑20 cm)，取上清，蛋白BCA試劑盒確定總蛋白濃度，將待測(cè)蛋白樣品進(jìn)行電泳分離(100V，80 min)，轉(zhuǎn)至PVDF膜(250 mA)，用50 g·L-1脫脂牛奶封閉2 h，將樣品與TLR4(1：200)、My D88(1：500)、NF-κB p65(1：1000)、p-NF-κB p65(1：1000)一抗進(jìn)行孵育(4℃，24 h)，TBST緩沖液洗膜，加二抗室溫孵育(HRP標(biāo)記IgG，1：5000，2 h)，洗膜，曝光，顯影。Image J軟件測(cè)樣品條帶與GAPDH條帶灰度值。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算，即目標(biāo)條帶與GAPDH條帶灰度比值。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平比較 各組血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組血清IL-1β、IL-4、TNF-α水平升高，IFN-γ水平降低(P<0.05)；與模型組比較，ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽(yáng)性藥物組血清IFN-γ水平升高，IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低(均P<0.05)；與ISL低劑量組比較，ISL高劑量組、陽(yáng)性藥物組血清IFN-γ水平升高，IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低(均P<0.05)；與ISL高劑量組比較，陽(yáng)性藥物組血清IFN-γ水平升高，IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 血清IL-1β、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平比較Table 2 Comparison of serum IL-1β，IL-4，IFN-γ and TNF-α levels

2.2 腦組織病理學(xué)觀察 HE結(jié)果顯示，對(duì)照組腦組織神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、分布均勻、腦皮質(zhì)厚度適中，位于中央的核仁大且圓；模型組出現(xiàn)大量腦組織神經(jīng)元變性、壞死，數(shù)量減少，體積縮小，腦皮質(zhì)厚度變薄，細(xì)胞核發(fā)生移位、結(jié)構(gòu)模糊，核仁消失。ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽(yáng)性藥物組腦組織神經(jīng)元損傷較模型組均出現(xiàn)不同程度改善，其中ISL高劑量組、陽(yáng)性藥物組改善顯著，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少、體積縮小，腦皮質(zhì)厚度變薄，細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)較清晰。見(jiàn)圖1。

2.3 TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA水平比較 各組腦組織TLR4、My D88 mRNA水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組腦組織TLR4、My D88 mRNA水平升高(均P<0.05)；與模型組比較，ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽(yáng)性藥物組腦組織TLR4、My D88 mRNA水平降低(均P<0.05)；與ISL低劑量組比較，ISL高劑量組、陽(yáng)性藥物組腦組織TLR4、My D88 mRNA水平降低，且陽(yáng)性藥物組低于ISL高劑量組(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 腦組織TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA水平比較

2.4 TLR4、My D88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白水平比較 各組腦組織TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組腦組織TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平升高(均P<0.05)；與模型組比較，ISL低劑量組、ISL高劑量組、陽(yáng)性藥物組腦組織TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平降低(均P<0.05)；與ISL低劑量組比較，ISL高劑量組、陽(yáng)性藥物組腦組織TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平降低，且陽(yáng)性藥物組低于ISL高劑量組(均P<0.05)。見(jiàn)圖2、表4。

表4 TLR4、My D88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白水平比較Table 4 Comparison of protein levels of TLR4，My D88，NF-κB p65，and p-NF-κB p65

3 討論

TBI是一種高度異質(zhì)性損傷，可導(dǎo)致一系列暫時(shí)或永久性神經(jīng)系統(tǒng)改變，其主要病理特征為神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、興奮性毒性和線粒體功能障礙等[10]。TBI又被認(rèn)為是一種“雙相損傷”，即原發(fā)性損傷和延遲的繼發(fā)性損傷。原發(fā)損傷是指由機(jī)械損傷直接引起的即刻損傷，包括軸突剪切、出血和挫傷，并依據(jù)不同損傷嚴(yán)重程度分為輕度、中度和重度[11]。而繼發(fā)損傷是指由于原發(fā)損傷引發(fā)病理生理變化進(jìn)而引起的進(jìn)一步損傷，包括線粒體功能障礙、氧化損傷和神經(jīng)炎癥在內(nèi)的分子過(guò)程構(gòu)成的神經(jīng)元損傷和退化[12]。TBI病理過(guò)程復(fù)雜，不僅涉及到外力間接或直接作用引起的損傷，之后繼發(fā)的神經(jīng)元細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的改變，可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡或死亡，引起神經(jīng)功能障礙。迄今為止，盡管眾多學(xué)者對(duì)TBI進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)與臨床研究，但具體作用機(jī)制尚不清晰。

神經(jīng)炎癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)損傷反應(yīng)的主要病理生理特征，包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、促炎細(xì)胞因子表達(dá)、小膠質(zhì)細(xì)胞活化等[13]。TNF-α是一種重要炎性介質(zhì)趨化因子，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞浸入炎癥局部，進(jìn)而加重炎癥浸潤(rùn)導(dǎo)致組織損傷；IL-1β作為一級(jí)炎癥細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)炎細(xì)胞活性[14-15]。IFN-γ、IL-4分別體現(xiàn)Th1、Th2型淋巴細(xì)胞主要生物學(xué)效應(yīng)，常被用于細(xì)胞免疫功能的檢測(cè)指標(biāo)，一般情況下，機(jī)體自身Th1/Th2細(xì)胞處于相對(duì)平衡狀態(tài)，一旦機(jī)體免疫功能發(fā)生異常，其相對(duì)平衡狀態(tài)遭到破壞，進(jìn)而導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞失衡[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，ISL低、高劑量組大鼠血清IFN-γ水平升高、TNF-α、IL-1β、IL-4水平降低，炎性反應(yīng)得以改善。HE結(jié)果顯示，ISL低、高劑量組腦組織神經(jīng)損傷較模型組均出現(xiàn)不同程度改善，其中ISL高劑量組腦組織神經(jīng)損傷改善明顯，與陽(yáng)性藥物組效果相當(dāng)，揭示經(jīng)ISL干預(yù)后，Th1/Th2比值升高，Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡得以修復(fù)，能有效抑制相關(guān)炎性因子釋放進(jìn)而減輕炎性反應(yīng)及組織結(jié)構(gòu)破壞，表明ISL可通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，改善TBI大鼠炎性反應(yīng)，減輕腦組織損傷。

TLRs屬于跨膜蛋白家族受體，在非特異性或先天免疫防御中起關(guān)鍵作用。所有TLR家族成員中，TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)[17]。MyD88是TLR4的關(guān)鍵銜接蛋白，可激活下游NF-κB因子以及與神經(jīng)毒性有關(guān)的促炎細(xì)胞因子。TLR4將細(xì)胞內(nèi)IL-1β同源域激活，通過(guò)介導(dǎo)下游信號(hào)分子MyD88激活NF-κB效應(yīng)因子，其中NF-κB易轉(zhuǎn)位為核磷酸化，調(diào)節(jié)免疫炎癥因子表達(dá)[18]。已有研究[19]證實(shí)，經(jīng)外部刺激后，生物體發(fā)起先天性免疫應(yīng)答，TLR4表達(dá)上調(diào)，并激活NF-κB通過(guò)MyD88的依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑B，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的異常腸黏膜上皮炎癥。此外，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放并誘導(dǎo)神經(jīng)元變性和細(xì)胞凋亡[20]。Wang等[21]研究證實(shí)，在TBI小鼠模型中，雌二醇可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減少神經(jīng)毒性，減輕神經(jīng)炎性損傷[21]。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。以上研究均表明TLR4在TBI中發(fā)揮關(guān)鍵作用，本研究結(jié)果顯示，ISL能顯著降低TBI大鼠腦組織TLR4、My D88 mRNA和TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)，提示ISL可通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路關(guān)鍵分子表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)以及腦組織損傷，從而降低機(jī)體損害風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

ISL可明顯改善TBI大鼠腦組織損傷，通過(guò)調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB通路相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游炎癥因子表達(dá)，恢復(fù)Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡，減輕免疫炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮腦組織保護(hù)作用。本研究可為臨床ISL相關(guān)藥物研發(fā)及TBI治療提供新的途徑和方法。