李亞楠，司明輝，張文雙

近年來由于耐藥基因傳播模式及血清型替換導(dǎo)致的群體結(jié)構(gòu)改變，非疫苗血清型（NVT）多重耐藥肺炎鏈球菌（MRSP）的出現(xiàn)在國際公共衛(wèi)生和臨床環(huán)境中引起了極大的關(guān)注。肺炎鏈球菌感染至今仍是5歲以下兒童死亡的重要原因，每年達(dá)70萬～100萬，其中多數(shù)在發(fā)展中國家。據(jù)WHO報(bào)道，盡管至今未出現(xiàn)對(duì)萬古霉素耐藥的肺炎鏈球菌，侵襲性感染的病死率仍高達(dá)10%～40%[1]。20世紀(jì)以來，根據(jù)血清型流行概況研制出可覆蓋多種血清型的肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗（pneumococcal conjugate vaccine，PCV）：PCV7、PCV10、PCV13等，大大降低了侵襲性肺炎鏈球菌疾病（invasive pneumococcal diseases，IPD）的發(fā)生率[2]。2010年P(guān)CV13在美國應(yīng)用后，侵襲性肺炎鏈球菌臨床分離株只有1/4為疫苗覆蓋血清型，大部分感染為NVT，尤其在血液腫瘤等免疫功能低下和膿毒癥的患者。在一項(xiàng)薈萃分析中發(fā)現(xiàn)已經(jīng)將PCV13納入免疫規(guī)劃的國家，42.2%的兒童IPD病例由非PCV13血清型引起，尤其是在歐洲和北美，說明NVT的增加在逐漸抵消PCV的作用[3]。但我國的PCV接種并未納入免疫規(guī)劃，且肺炎鏈球菌疾病的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)尚不完善，僅能了解區(qū)域性的流行概況。2020年CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)的結(jié)果顯示上海地區(qū)兒童患者中分離的耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）菌株中，96.2%對(duì)紅霉素耐藥，對(duì)克林霉素耐藥率達(dá)到92.3%，對(duì)甲氧芐啶-磺胺甲唑全部耐藥，致死率在2007—2015年也在增加。我國對(duì)NVT肺炎鏈球菌的耐藥性研究較少，但在國外卻頻頻出現(xiàn)在疫苗接種后由于重組事件等造成的NVT MRSP感染疾病的增加。本文就近5年對(duì)NVT MRSP的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述及展望，以便為我國血清型流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)、臨床醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)性用藥、免疫策略的開發(fā)與應(yīng)用提供參考思路。

1 引入PCV后MRSP血清型流行現(xiàn)狀

1.1 國外MRSP血清型流行現(xiàn)狀

PCV已經(jīng)被100多個(gè)國家納入免疫規(guī)劃，在引入后的20年間對(duì)菌株血清型及耐藥性監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)NVT逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，成為引入疫苗后的研究熱點(diǎn)，現(xiàn)著重介紹PCV13應(yīng)用后最常見NVT 11A和15A MRSP菌株的耐藥現(xiàn)狀。

NVT 11A是鼻咽部肺炎鏈球菌分離株最普遍的血清型之一，Baek等[4]發(fā)現(xiàn)其在PCV引入后的8年間從3.2%增加到13.2%，在收集到的1 579株肺炎鏈球菌分離株中，發(fā)現(xiàn)多重耐藥甚至廣泛耐藥（XDR）的菌株，超過60%的11A菌株對(duì)頭孢呋辛、克林霉素和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥，多位點(diǎn)序列分型鑒定出2個(gè)主要克隆復(fù)合群CC166和CC99，其中多重耐藥克隆群CC166的ST8279、ST9875和ST3598菌株對(duì)該研究檢測(cè)的所有抗菌藥物均不敏感。

最常見的MRSP NVT為15A-ST63，各個(gè)國家的分布不同。見表1。在加拿大觀察到成人肺炎鏈球菌疾病中NVT 22F、15A和8在最流行的血清型排序分別為第1、第5和第7種，全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)血清型15A均為多重耐藥菌株[5]；在之前的報(bào)道中就已發(fā)現(xiàn)該血清型分離株對(duì)青霉素、克拉霉素和多西環(huán)素具有耐藥性[6]。英國公共衛(wèi)生部及抗菌化療協(xié)會(huì)在對(duì)抗生素使用的監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)NVT 15A在2011年明顯增加，在15A導(dǎo)致的IPD中，分離株中有26%～33%是三重耐藥，即大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和青霉素類耐藥，2013—2015年監(jiān)測(cè)顯示15A是最流行的血清型，其中38%～48%具有三重耐藥性，且?guī)缀跛械亩嘀啬退?5A菌株經(jīng)多位點(diǎn)序列分型均屬于ST63[7]。近期在挪威的一項(xiàng)報(bào)道中顯示接種PCV13期間，多重耐藥分離株引起的IPD發(fā)病率從2004年的0.11/10萬上升到2016年的0.38/10萬，而這種增加 是 由 于NVT 15A （ST63）、24F（ST162）、23B（ST2372）和33F引起，其中血清型15A是多重耐藥IPD增加的主要驅(qū)動(dòng)力，經(jīng)基因分型后發(fā)現(xiàn)幾乎所有的15A多重耐藥分離株均屬于ST63，自2008年以來，該克隆流行率越來越高，覆蓋了多重耐藥分離株的52%[8]；2019年冰島一項(xiàng)對(duì)照試驗(yàn)顯示MRSP菌株自PCV10引入后從34.4%下降至23.9%，87.9%的PRSP菌株是多重耐藥，但在疫苗接種后4年減少到72.9%，NVT多重耐藥菌株 6C、15A卻分別從0.9%、0.9%上升至16.4%、9.1%[9-10]；相似地，保加利亞也報(bào)告了NVT 6C和15A同樣的耐藥現(xiàn)況[11-12]。2014年西班牙的一項(xiàng)耐藥監(jiān)測(cè)分析中也顯示與2006年相比，2012年的多重耐藥率增加，主要是由于NVT相關(guān)的克隆復(fù)合群的出現(xiàn)或增加，如表現(xiàn)為8、15A和19A血清型的CC63、19A/CC320、23A/CC42[13]，提示血清型替換已經(jīng)成為疫苗接種后的“常駐”現(xiàn)象。

表1 不同國家/地區(qū)耐多藥15A-ST63對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率

2015年Ozawa等[14]在分析PCV7對(duì)日本兒童急性中耳炎的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)NVT 15A造成的高患病率成為難治性中耳炎的重要危險(xiǎn)因素，常出現(xiàn)于1歲以下的嬰兒，并成為繼19A之后的第二大血清型，且均為多重耐藥。隨后Naito等[15]也發(fā)現(xiàn)血清型6C、15A、15C和19A增加，多藥耐藥克隆在疫苗引入前期（Spain6B-2/ST90、Taiwan19F-14/ST236）下降，而Sweden15A-25/ST63是疫苗后期的優(yōu)勢(shì)克隆。PCV13在2010年引入韓國后，兒童的接種率＞95%，成人接種率約為15%，而在中國，PCV并未納入免疫規(guī)劃，接種率不到1%，2019年亞洲一項(xiàng)多中心研究調(diào)查顯示韓國和中國MRSP的比例約50.8%，遠(yuǎn)高于世界其他地區(qū)的報(bào)告，如美國的21.8%[16]，特別是19F和19A的分離株中，多重耐藥比例相對(duì)較高，在其他研究中發(fā)現(xiàn)了15A、15B、35B和23A血清型等也有類似趨勢(shì)[17-21]； 2021年韓國在近10年間耐藥監(jiān)測(cè)中也發(fā)現(xiàn)，由非PCV13血清型引起的感染以及由NVT MRSP引起的IPD的比例增加，肺炎鏈球菌多重耐藥率在近10年由0.9%上升至25.5%，成為亟待解決的“熱點(diǎn)”問題[22]。

1.2 國內(nèi)MRSP血清型的流行現(xiàn)狀

我國香港、臺(tái)灣是最先將PCV納入“國家免疫計(jì)劃”的地區(qū)。自2013年引入PCV13，2020年Wu等[23]對(duì)PCV引入前后抗生素敏感性進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)盡管血清型19A在后PCV7/前PCV13期間仍占領(lǐng)主導(dǎo)地位，但NVT 15A和23A已超過19A，成為2018年的前兩個(gè)主要血清型，且新出現(xiàn)的血清型15A和23A均為多重耐藥，對(duì)β內(nèi)酰胺類藥物和幾種非β內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性均較高。而我國內(nèi)地缺乏肺炎鏈球菌的監(jiān)測(cè)機(jī)制，非NVT MRSP的研究較少，缺乏相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

2 NVT肺炎鏈球菌多重耐藥的影響因素

2019年全球肺炎鏈球菌測(cè)序計(jì)劃啟動(dòng)后，全基因組測(cè)序能夠進(jìn)一步了解NVT肺炎鏈球菌對(duì)抗生素耐藥的機(jī)制，如利用基因的重組比來預(yù)測(cè)抗生素的耐藥性，重組比越高，抗生素耐藥性的平均類別數(shù)越高；利用基因組聚集成譜系定義全球肺炎鏈球菌序列簇GPSC并構(gòu)建抗生素圖，更有助于了解肺炎鏈球菌血清型與耐藥性地理區(qū)域傳播的背景[24]。國內(nèi)對(duì)于NVT肺炎鏈球菌流行病學(xué)曾有描述，耐藥性卻很少涉及，現(xiàn)根據(jù)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀總結(jié)如下。

2.1 抗生素的廣泛應(yīng)用

菌株可通過抗生素的選擇性壓力突變而產(chǎn)生耐藥性[1，25-27]。2003年Ruhe等[28]應(yīng)用多元logistic分析證實(shí)既往抗生素的使用是青霉素不敏感肺炎鏈球菌（PNSP）感染的預(yù)測(cè)因素，此項(xiàng)研究比較全面，在出現(xiàn)感染癥狀前1個(gè)月和6個(gè)月使用β內(nèi)酰胺類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物與PNSP菌血癥相關(guān)，即短期和長(zhǎng)期使用β內(nèi)酰胺類都可以顯著增加PNSP感染的風(fēng)險(xiǎn)，暴露在不同的抗菌藥物種類及時(shí)間的長(zhǎng)短均可引起不同程度的抗菌藥物耐藥，成為耐藥性產(chǎn)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。肺炎鏈球菌產(chǎn)生耐藥性會(huì)造成難治性中耳炎、腦膜炎治療失敗，尤其是NVT MRSP的感染，PCV預(yù)防失敗的情況下，最終可能會(huì)導(dǎo)致無藥可用的不利境況。有研究報(bào)道稱，日本某些地區(qū)出現(xiàn)耐美羅培南的多重耐藥菌株15A-ST63，這與當(dāng)?shù)亻T診廣泛大量應(yīng)用廣譜抗生素有關(guān)，抗生素的不合理應(yīng)用可能提供選擇性壓力從而使多重耐藥菌株傳播[29]。在2020年的中國肺炎鏈球菌感染診療及預(yù)防共識(shí)中，指出血清型可能是肺炎鏈球菌腦膜炎嚴(yán)重程度的重要決定因素，尤其在1月齡以上嬰兒及兒童中，不得不考慮在疫苗防治失敗、耐藥菌株存在、萬古霉素滲透腦脊液范圍有限的情況下，如何早期經(jīng)驗(yàn)性用藥，以避免延誤治療而導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至死亡[1，30]。

2.2 基因的水平轉(zhuǎn)移

Janoir等[31]分別對(duì)PCV7引入后期及PCV13引入后期IPD中分離出的肺炎鏈球菌菌株進(jìn)行耐藥表型的研究，發(fā)現(xiàn)NVT 12F、24F、15A和35B始終與1種或多種抗生素的耐藥性相關(guān)，但15A和35B菌株的耐藥率在兩個(gè)時(shí)期并未發(fā)生變化，證明這些NVT的增加可能并不僅僅是由抗生素壓力驅(qū)動(dòng)。肺炎鏈球菌是一種高度重組病原體，可通過攝取和整合來自其他肺炎球菌菌株和其他相關(guān)非致病性緩解組物種的DNA而自然轉(zhuǎn)化。Arushothy等[32]在對(duì)1例死于感染的20月齡患者血液標(biāo)本中分離出的血清型15A-ST1591肺炎鏈球菌菌株的研究中發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)紅霉素、甲氧芐啶-磺胺甲唑、四環(huán)素、氯霉素、青霉素、頭孢曲松和頭孢噻肟均耐藥，該克隆與CC81克隆復(fù)合群相關(guān)，且在掃描電鏡中觀察到19A（ATCC 700673）和血清型15A（SS40_16）之間可能存在水平基因轉(zhuǎn)移，這是第一個(gè)血清型之間基因轉(zhuǎn)移的可能性和效果的證據(jù)，他們之間共享的脂多糖基質(zhì)賦予了高抗性的表型特征。日本在2012—2014年對(duì)收集的全國兒童NVT 15A的肺炎鏈球菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了15A-CC63的新克隆ST9084，該克隆對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素、頭孢噻肟和美羅培南耐藥，原因是在青霉素結(jié)合蛋白PBP2x區(qū)域發(fā)生了重組，導(dǎo)致了額外的頭孢噻肟耐藥，且該類菌株pbp1a、pbp2b和pbp2x的保守氨基酸序列與血清型19A-ST320的相同[33]；另1項(xiàng)葡萄牙的研究使用肺炎鏈球菌定植和感染小鼠模型，結(jié)合分離自已接種PCV7的兒童鼻咽部多重耐藥肺炎鏈球菌的全基因組測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，多重耐藥15A-ST63是19F克隆G54的莢膜轉(zhuǎn)換產(chǎn)物[34]；Nakano等[35]在追溯可以促進(jìn)美羅培南耐藥的血清型15A-ST63中pbp1a-13序列的來源時(shí)發(fā)現(xiàn)，44.5%的血清型19A分離株檢測(cè)到pbp1a-13，提示19A-CC3111克隆可能是PBP1a的主要存儲(chǔ)庫，pbp1a區(qū)可能在不同血清型菌株之間水平轉(zhuǎn)移，但pbp1a-13單獨(dú)存在時(shí)可能只導(dǎo)致青霉素耐藥性，pbp2b或pbp2x區(qū)域的青霉素結(jié)合蛋白（PBP）重組并與pbp1a-13結(jié)合導(dǎo)致多重耐藥，再次證明了血清型之間的水平基因轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致多重耐藥。近期Savinova等[36]研究了1種由血清型19A莢膜轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的耐多藥NVT 15A菌株，以血清型15A-ST14599（Sp1994）做參考，進(jìn)行了全基因組測(cè)序及單核苷酸多態(tài)性系統(tǒng)發(fā)育分析，將不同序列類型的15A與19A基因組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示Sp1994與所檢測(cè)的19A-ST276基因組親緣關(guān)系更相近，表明了二者之間密切的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，證明15A分離株在轉(zhuǎn)換過程中獲得了cps基因座而產(chǎn)生了具有多重耐藥表型的重組體。肺炎鏈球菌的高重組率促進(jìn)了血清型的轉(zhuǎn)換及耐藥基因的獲得及傳播，自全球肺炎鏈球菌測(cè)序計(jì)劃開展以來，英國公共衛(wèi)生部建議可以利用肺炎鏈球菌全基因組測(cè)序來確定血清型與抗生素敏感性的關(guān)系[24]，這一舉措有利于觀察菌株血清型轉(zhuǎn)換的發(fā)生及耐藥性的變化，為臨床合理性選擇和用藥提供了指導(dǎo)性意見。

2.3 疫苗的接種

2018年Obolski等[37]通過構(gòu)建血清型和抗生素耐藥性變化的理論框架，說明了接種疫苗可以消除疫苗血清型與NVT的競(jìng)爭(zhēng)，從而導(dǎo)致先前存在的NVT耐藥變異體的頻率快速增加，即耐藥性增加。因此避免PCV對(duì)肺炎鏈球菌血清型的選擇壓力顯得至關(guān)重要，但由于目前PCV對(duì)耐藥性的研究有限，仍需進(jìn)一步深究。

3 結(jié)語與展望

綜上所述，肺炎鏈球菌感染仍是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生危害。盡管隨著地域不同，受到PCV的影響不同，但引入疫苗后NVT MRSP菌株的傳播逐漸成為一種流行趨勢(shì)，目前的疫苗仍是以肺炎鏈球菌莢膜多糖為抗原，成本較高且血清型覆蓋類型有限，因此需要開發(fā)新的持久保護(hù)、適應(yīng)性更強(qiáng)、成本更低的防治策略。近年來隨著基因組技術(shù)的發(fā)展，肺炎鏈球菌毒力因子的研究成為熱點(diǎn)，以此作為基礎(chǔ)研發(fā)獨(dú)立于血清型的疫苗層出不窮，如利用肺炎鏈球菌TIGR4裂解液制備的多抗原疫苗（MAV）[38]，全細(xì)胞肺炎鏈球菌疫苗（WCV）[39]，PspA重組抗原疫苗[40]等；在治療方面，Liakopoulos等[41]用棋盤法和紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)證實(shí)了Mn復(fù)合物[Mn（CO）3（tpa-κ3N）]Br對(duì)臨床相關(guān)肺炎鏈球菌具有體內(nèi)外抗菌活性，并有可能與現(xiàn)有抗生素聯(lián)合使用，提高對(duì)MRSP的有效性，但均缺乏臨床試驗(yàn)。因此，針對(duì)肺炎鏈球菌疫苗后血清型轉(zhuǎn)換及多重耐藥等諸多問題需給予高度重視，預(yù)防及治療肺炎鏈球菌感染有待開拓新思路。