麻仕璽 花奇凱* 鄺曉聰 韋 姣 莫 燕 候 俊

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科,廣西南寧市 530021;2 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西南寧市 530021；3 廣西醫(yī)科大學(xué)玉林校區(qū)，廣西玉林市 537000)

糖尿病足創(chuàng)面是一種典型的難愈性創(chuàng)面，目前采用脛骨橫向骨搬移(tibial transverse transport，TTT)技術(shù)治療效果顯著[1]，其可促進(jìn)創(chuàng)面原組織再生修復(fù)[2]，但對(duì)該技術(shù)治療效果的生物學(xué)機(jī)制尚未清楚。本研究通過(guò)觀察創(chuàng)面再生愈合時(shí)相變化及微血管形成和巨噬細(xì)胞極化情況，對(duì)TTT技術(shù)促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制作初步探討。

1 對(duì)象及方法

1.1 觀察對(duì)象 選擇2017～2020年在廣西醫(yī)科大學(xué)關(guān)節(jié)外科住院治療的重度糖尿病足患者61例為研究對(duì)象，患者年齡34～83(60.82±9.91)歲,糖尿病足病程1～72(5.43±9.96)個(gè)月,Wagner分級(jí)3～5級(jí)?？紤]到免疫組化檢測(cè)的資金及患者依從性問(wèn)題，從61例患者中隨機(jī)挑選Wagner分級(jí)3、4、5級(jí)各4例患者進(jìn)行創(chuàng)面邊緣組織免疫組化檢測(cè)，12例患者均知情同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)： (1)糖尿病足Wagner分級(jí)3～5級(jí)；(2)患者院外經(jīng)血糖控制、創(chuàng)面換藥，創(chuàng)面依然遷延不愈。排除標(biāo)準(zhǔn)：B超或血管造影檢查顯示患者腘動(dòng)脈流出道狹窄>85%；患者因客觀或主觀因素不配合手術(shù)及后期治療；患者近期發(fā)生過(guò)心腦血管事件或存在心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。

1.3 材料 鼠抗人CD86、CD163、CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)單克隆抗體(美國(guó)CST公司)，含10 mL/kit正常羊血清原液、生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG、1 mL/kit辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素原液3種試劑的免疫組化染色試劑盒(廠(chǎng)家：中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 創(chuàng)面邊緣組織免疫組化檢測(cè) (1)取材固定：切取創(chuàng)面邊緣組織于10%的福爾馬林溶液中固定；(2)浸蠟包埋；(3)切片貼片；(4)脫蠟水化：二甲苯溶液通透，使用濃度分別為100%、95%、80%、70%的乙醇溶液及蒸餾水依次浸泡；(5)抗原熱修復(fù)：修復(fù)液中持續(xù)煮沸5 min，冷卻；(6)磷酸緩沖溶液(phosphate buffer solution，BPS)沖洗；(7)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性滅活：3%過(guò)氧化氫溶液浸泡，置于37 ℃溫箱15 min；(8)BPS沖洗；(9)封閉非特異蛋白：山羊血清；(10)Ⅰ抗孵育：(添加鼠抗人CD86、CD163、CD31、VEGF單克隆抗體1 ∶500)，置于4 ℃冰箱過(guò)夜；(11)37 ℃溫箱復(fù)溫，BPS沖洗；(12)Ⅱ抗孵育：滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG(1 ∶100)，37 ℃溫箱孵育15 min；(13)BPS沖洗；(14)滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素稀釋液(1 ∶100)，37 ℃溫箱放置15 min；(15)BPS沖洗；(16)二氨基聯(lián)苯胺顯色；(17)BPS沖洗；(18)蘇木素復(fù)染；(19)1%鹽酸酒精分化液分化；(20)飽和碳酸鋰溶液返藍(lán)；(21)濃度分別為75%、90%、95%、100%的乙醇溶液依次脫水，二甲苯溶液通透；(22)中性樹(shù)膠封片、顯微鏡下觀察染色情況，分別取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4.2 創(chuàng)面邊緣組織HE 染色 (1)取材固定：取創(chuàng)面邊緣組織于10%的福爾馬林溶液中固定；(2)浸蠟包埋；(3)切片貼片；(4)脫蠟水化：二甲苯脫蠟，用濃度分別為100%、95%、75%的乙醇溶液及蒸餾水依次浸泡水化；(5)染色：蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化液分化，水洗，飽和碳酸鋰溶液返藍(lán)，75%乙醇溶液脫水，伊紅染色液染色；(6)脫水通透：95%、100%乙醇溶液脫水，用二甲苯乙醇溶液(1 ∶1)、二甲苯依次浸泡。

1.5 觀察指標(biāo) (1)觀察患者術(shù)后創(chuàng)面的愈合情況。(2)術(shù)前、術(shù)后1個(gè)月創(chuàng)面邊緣組織CD86及CD163免疫組化染色結(jié)果、陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和M1/M2值(分別以CD86、CD163單克隆抗體標(biāo)記M1、M2型巨噬細(xì)胞，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，CD86陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與CD163陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之比即為M1/M2值)，以及CD31和VEGF免疫組化染色結(jié)果、陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)變化。(3)術(shù)前、術(shù)后1個(gè)月創(chuàng)面邊緣組織HE染色情況。(4)術(shù)前及術(shù)后1個(gè)月，行足部血管造影檢查觀察足部微血管變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，術(shù)前術(shù)后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面愈合情況 61例患者創(chuàng)面全部愈合，愈合時(shí)間為1～12(3.83±2.31)個(gè)月。創(chuàng)面愈合過(guò)程基本按炎癥期、增殖期和重塑期3個(gè)階段發(fā)展，炎癥期可見(jiàn)創(chuàng)面黃白、滲液、組織壞死(圖1A、1B)；增殖期潰瘍創(chuàng)面炎癥逐漸消退，開(kāi)始出現(xiàn)粉紅色顆粒狀肉芽組織，創(chuàng)面邊緣上皮組織逐漸向創(chuàng)面中心爬行(圖1C、1D)；重塑期愈合的創(chuàng)面皮膚外觀逐漸接近正常組織(圖1E)。創(chuàng)面愈合期間有部分患者會(huì)出現(xiàn)炎癥期反復(fù)和炎癥期與增殖期的重疊。

圖1 不同時(shí)期的創(chuàng)面愈合過(guò)程形態(tài)變化

2.2 創(chuàng)面邊緣組織免疫組化染色結(jié)果 術(shù)前CD86陽(yáng)性細(xì)胞呈帶狀分布于表皮中，術(shù)后1個(gè)月可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞減少，呈散在分布(圖2)。術(shù)前CD163陽(yáng)性細(xì)胞主要位于真皮層中，術(shù)后1個(gè)月可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞比術(shù)前明顯減少(圖3)。術(shù)前VEGF陽(yáng)性細(xì)胞較少，術(shù)后比術(shù)前明顯增多(圖4)。術(shù)前CD31陽(yáng)性細(xì)胞較少，術(shù)后比術(shù)前明顯增多,并呈細(xì)小條索狀串聯(lián)，微血管數(shù)量增多(圖5)。

圖2 創(chuàng)面邊緣組織CD86免疫組化染色情況(×40、×100、×400)

圖3 創(chuàng)面邊緣組織CD163免疫組化染色情況(×40、×100、×400)

圖4 創(chuàng)面邊緣組織VEGF免疫組化染色情況(×100)

圖5 創(chuàng)面邊緣組織CD31免疫組化染色情況(×100)

2.3 手術(shù)前后M1、M2 型巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)及M1/M2變化情況 術(shù)后M1型巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(79.74±13.96)較術(shù)前(158.18±29.14)明顯減少(t=12.390，P<0.001)；術(shù)后M2型巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(32.27±6.62)較術(shù)前(43.64±7.70)減少(t=4.407，P<0.001)；術(shù)后M1/M2(2.50±0.29)較術(shù)前(3.62±0.18)降低(t=9.974，P<0.001)。

2.4 創(chuàng)面邊緣組織HE染色 術(shù)前HE染色顯示組織殘缺,未見(jiàn)皮膚附屬器(圖6A、6B、6C)；術(shù)后組織結(jié)構(gòu)完整,可見(jiàn)腺體樣結(jié)構(gòu)和膠原沉積(圖6D、6E、6F)。

圖6 創(chuàng)面邊緣組織手術(shù)前后HE染色情況(比例尺625 μm、200 μm、100 μm)

2.5 足部血管造影檢查 術(shù)前微血管少(圖7A)；術(shù)后1個(gè)月微血管增多,側(cè)支微循環(huán)形成(圖7B)。

圖7 足部血管造影檢查的影像學(xué)資料

3 討 論

生物力學(xué)領(lǐng)域中，張力-應(yīng)力法則是對(duì)生物組織施加持續(xù)牽拉應(yīng)力，使張力-應(yīng)力的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號(hào)，激發(fā)組織細(xì)胞增殖，促進(jìn)組織再生。TTT是以張力-應(yīng)力激發(fā)細(xì)胞生物效應(yīng)而促進(jìn)創(chuàng)面組織再生的微創(chuàng)外科技術(shù)，其是在患者脛骨內(nèi)上側(cè)骨皮質(zhì)微創(chuàng)開(kāi)窗，經(jīng)搬移裝置對(duì)皮質(zhì)截骨片持續(xù)施加牽張應(yīng)力，由此產(chǎn)生生物效應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面組織再生修復(fù)[3]。本研究中，61例重度糖尿病足患者接受TTT術(shù)后創(chuàng)面組織再生愈合，并且術(shù)后1個(gè)月取創(chuàng)面的新生皮膚做組織學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)其表皮、真皮和皮下組織等各層結(jié)構(gòu)完整，基底層的細(xì)胞增多，且在真皮與皮下組織發(fā)現(xiàn)膠原沉積和腺體樣結(jié)構(gòu)。足部血管造影檢查顯示術(shù)后1個(gè)月微血管及側(cè)支微循環(huán)形成增多。這提示TTT可促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面的組織再生。

本課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1個(gè)月外周血中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、單個(gè)核細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞上的CXCR4水平均較術(shù)前增高[4]，表明術(shù)后介導(dǎo)骨髓干細(xì)胞動(dòng)員的重要信息通路SDF-1/CXCR4信號(hào)軸活性增強(qiáng)，骨髓干細(xì)胞動(dòng)員效應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)入創(chuàng)面向組織細(xì)胞分化的干細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)增多，這可能是創(chuàng)面組織再生最重要的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)。

本研究中大部分糖尿病足患者的創(chuàng)面在術(shù)后1～2周出現(xiàn)炎性分泌物逐漸減少，炎癥減輕，局部開(kāi)始生長(zhǎng)粉紅肉芽組織的情況，即使部分創(chuàng)面局部壞死，經(jīng)過(guò)再次清創(chuàng)，亦能長(zhǎng)出粉紅肉芽組織，這是創(chuàng)面愈合早期的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折，標(biāo)志著創(chuàng)面從遷延不愈的炎癥期進(jìn)入細(xì)胞增殖分化、組織再生的增殖期。有研究表明，創(chuàng)面愈合受多種因素的共同作用影響，巨噬細(xì)胞的生物效應(yīng)在創(chuàng)面組織再生的過(guò)程中具有重要的促進(jìn)作用[5-6]。而創(chuàng)面巨噬細(xì)胞的生物效應(yīng)取決于巨噬細(xì)胞的數(shù)量和表型，尤其是M1/M2平衡[7]。 因此，本研究主要從創(chuàng)面巨噬細(xì)胞極化、創(chuàng)面愈合分期和微血管增加的角度來(lái)進(jìn)行初步分析。

術(shù)前創(chuàng)面黃白、水腫，可見(jiàn)壞死組織和炎性分泌物，處于炎癥期，這一時(shí)期糖尿病足創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)量和功能異常，M1型巨噬細(xì)胞釋放大量炎性因子[8]，創(chuàng)面高炎狀態(tài)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2表型極化障礙[9],進(jìn)而導(dǎo)致創(chuàng)面基質(zhì)金屬蛋白酶增多，降解細(xì)胞外基質(zhì)及生長(zhǎng)因子，阻斷創(chuàng)面血管發(fā)生，膠原沉積減少[10-11]，這是導(dǎo)致創(chuàng)面炎癥遷延不愈并停滯于炎癥期的因素之一。術(shù)后1個(gè)月M1、M2型巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)均比術(shù)前減少，提示術(shù)后創(chuàng)面從高炎狀態(tài)進(jìn)入低炎狀態(tài)；M1/M2減小，表明M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，M1、M2型巨噬細(xì)胞趨向平衡。進(jìn)入創(chuàng)面的干細(xì)胞分泌前列腺素E2、TSG-6、白介素-10等細(xì)胞因子以及外泌體，并以旁分泌或其他方式作用于巨噬細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信息通路，抑制炎性因子的表達(dá)，上調(diào)抗炎因子的表達(dá)[12]，這是干細(xì)胞誘導(dǎo)創(chuàng)面巨噬細(xì)胞表型重新編程的主要細(xì)胞生物效應(yīng)，可誘導(dǎo)促炎型M1型巨噬細(xì)胞向抗炎型M2型巨噬細(xì)胞極化。此外，巨噬細(xì)胞炎性因子的表達(dá)、分泌減少，由TNF-α等炎性因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化形成的M1型巨噬細(xì)胞隨之減少，從而改變創(chuàng)面炎性狀態(tài)。以上因素的綜合作用使創(chuàng)面巨噬細(xì)胞發(fā)生質(zhì)變、量變，生物效應(yīng)也隨之改變。隨著M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，M1/M2逐漸降低，創(chuàng)面逐漸從M1型巨噬細(xì)胞生物效應(yīng)占主導(dǎo)作用轉(zhuǎn)變成M2型巨噬細(xì)胞生物效應(yīng)占主導(dǎo)作用。M2型巨噬細(xì)胞主要分泌VEGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等促血管生成因子，促進(jìn)創(chuàng)面炎癥消退和細(xì)胞增殖、分化，介導(dǎo)創(chuàng)面血管生成[13-19]。然而這些因子的分泌量取決于創(chuàng)面巨噬細(xì)胞M1/M2的平衡，M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)血管生成因子的分泌量也隨而增加。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β調(diào)控相關(guān)信息通路誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向創(chuàng)面遷移募集[15],VEGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、募集，基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-3在細(xì)胞遷移的前沿區(qū)域降解纖維蛋白和其他基質(zhì)成分，有利于干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及管樣結(jié)構(gòu)的形成。血小板衍生生長(zhǎng)因子介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞和周細(xì)胞的錨定，有助于創(chuàng)面新生毛細(xì)血管的功能和形態(tài)的維持[20]。此時(shí)，創(chuàng)面從炎癥期進(jìn)入增殖期，臨床可見(jiàn)創(chuàng)面炎性分泌物消退，開(kāi)始生長(zhǎng)出紅潤(rùn)顆粒狀肉芽組織。綜上，從創(chuàng)面巨噬細(xì)胞極化的生物效應(yīng)與創(chuàng)面愈合的關(guān)系來(lái)說(shuō)，M1、M2型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞生物效應(yīng)在創(chuàng)面血管生成過(guò)程中分別起抑制和促進(jìn)效應(yīng)。

VEGF是最強(qiáng)的血管生成誘導(dǎo)因子，其在細(xì)胞外基質(zhì)中分布的空間梯度是血管形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵因素。CD31是血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物。本研究中術(shù)后1個(gè)月創(chuàng)面邊緣組織中VEGF、CD31密度均比術(shù)前增加，并且CD31陽(yáng)性細(xì)胞呈細(xì)小條索狀串聯(lián)，提示術(shù)后創(chuàng)面組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞增多，微血管的生成增多。術(shù)后1個(gè)月血管造影結(jié)果顯示創(chuàng)面微血管比術(shù)前增多，下肢血管網(wǎng)的小血管開(kāi)始增加，提示糖尿病足創(chuàng)面血供改善。創(chuàng)面中血管生成有利于創(chuàng)面組織再生相關(guān)的細(xì)胞、細(xì)胞因子以及創(chuàng)面組織代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸，這是再生修復(fù)的先決條件。

綜上所述，TTT可能通過(guò)誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)創(chuàng)面M1、M2型巨噬細(xì)胞平衡,使創(chuàng)面M2型巨噬細(xì)胞生物效應(yīng)占主導(dǎo)作用，促使創(chuàng)面從炎癥期進(jìn)入增殖期，促進(jìn)創(chuàng)面組織的微血管再生，為糖尿病足潰瘍和再生愈合提供血供基礎(chǔ)和良好的微環(huán)境。但TTT技術(shù)相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制還有待不斷地深入研究，以便推動(dòng)其發(fā)展和應(yīng)用。