曹俊杰，黃 劍，劉占鰲，霍桂軍，湯 堯

[南京醫(yī)科大學姑蘇學院/南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院(本部)血管外科，江蘇蘇州 215002]

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，極大威脅人類生命健康。血管內(nèi)皮細胞是維持血管壁結(jié)構(gòu)和功能的重要屏障，其損傷是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)[1]。因此，抑制或減輕血管內(nèi)皮細胞損傷是預防和治療AS的重要途徑。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類非編碼RNA，可作為微RNA(microRNA，miRNA)分子海綿發(fā)揮作用，調(diào)控miRNA靶基因的表達，進而影響細胞生理或病理過程，參與人類多種疾病的發(fā)展進程[2-4]。研究顯示，circ_0062389在心力衰竭大鼠心肌組織中高表達，沉默其表達可明顯降低大鼠心肌細胞凋亡，改善大鼠心肌功能，其作用機制與調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/SMAD家族成員3(Smad3)信號通路有關(guān)，有可能成為治療心力衰竭的分子靶點[5]。但目前，circ_0062389對AS發(fā)生、發(fā)展的影響和機制還不清楚。Circular RNA Interactome靶基因在線軟件預測顯示，circ_0062389可能競爭性結(jié)合miRNA-331-3p。ZHANG等[6]研究顯示，脊髓損傷大鼠脊髓中miRNA-331-3p表達下調(diào)，miRNA-331-3p過表達可改善脊髓損傷大鼠運動能力，減輕脊髓組織損傷、神經(jīng)元凋亡和炎性反應(yīng)，可用作治療脊髓損傷的分子靶點。而目前miRNA-331-3p對AS發(fā)生、發(fā)展的影響還不清楚,因此，本研究通過建立氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷模型，觀察circ_0062389和miRNA-331-3p對血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響及circ_0062389可否通過調(diào)控miRNA-331-3p發(fā)揮作用，以期為AS的治療提供分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)，購自上海弘順生物科技有限公司。試劑：改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified EagleMedium,DMEM)和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-fluoresceinisothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡試劑盒，購自北京索萊寶公司；LipofectamineTM2000試劑盒，購自美國Invitrogen公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，購自浙江天杭州生物科技股份有限公司；circ_0062389小干擾RNA(si-circ_0062389)、小干擾RNA陰性序列(si-NC)、miRNA-331-3p抑制劑(anti-miRNA-331-3p)、抑制劑陰性序列(anti-miRNA-NC)、miRNA-331-3p 模擬物(mimics)、模擬對照序列(miRNA-NC)和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物，均購自上海生工生物工程有限公司；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，購自大連寶生物工程有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；兔抗人活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3和cleaved-caspase9單克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

復蘇HUVEC，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。取對數(shù)期HUVEC，將其接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養(yǎng)12 h后棄培養(yǎng)液。采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0062389、miRNA-NC、miRNA-331-3p mimics、共轉(zhuǎn)染si-circ_0062389與anti-miRNA-NC、si-circ_0062389與anti-miRNA-331-3p，轉(zhuǎn)染12 h后更換新鮮培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h后，實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)法檢測細胞中circ_0062389或miRNA-331-3p表達驗證轉(zhuǎn)染效果，并收集細胞備用。

1.2.2細胞分組處理

將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的HUVEC均接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養(yǎng)12 h后棄培養(yǎng)液。未轉(zhuǎn)染的HUVEC分為對照組(Con組)和ox-LDL組，Con組細胞用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，ox-LDL組細胞用含ox-LDL終濃度為100 μg/mL[7]的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0062389、miRNA-NC、miRNA-331-3p mimics、共轉(zhuǎn)染si-circ_0062389與anti-miRNA-NC、si-circ_0062389與anti-miRNA-331-3p的細胞均用含ox-LDL終濃度為100 μg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，并依次記為 ox-LDL+si-NC組(A組)、ox-LDL+si-circ_0062389組(B組)、ox-LDL+miRNA-NC組(C組)、ox-LDL+miRNA-331-3p組(D組)、ox-LDL+si-circ_0062389+anti-miRNA-NC組(E組)、ox-LDL+si-circ_0062389+anti-miRNA-331-3p組(F組)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細胞并用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)清洗2次，然后檢測以下指標。

1.2.3RT-qPCR檢測circ_0062389和miRNA-331-3p表達

用RNA抽提試劑盒提取各組HUVEC中總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，行PCR擴增。擴增程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。引物序列：circ_0062389上游5′-GTA CGA GAT GAG TCG ACG CGC-3′，下游5′-CGA TAG GCG CGA GCG AGC-3′；miRNA-331-3p上游5′-TCG GCA GGG CCC CTG GGC CTA-3′，下游5′-GCC CCU GGG CCU AUC CUA GAA-3′；GAPDH上游5′-GTT GGA GGT CGG AGT CAA CGG-3′，下游5′-GAG GGA TCT CGC TCC TGG AGG A-3′；U6上游5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游5′-CGC TTC AGA ATT TGC GTG TCA T-3′。2-ΔΔCt法計算circ_0062389 相對于GAPDH、miRNA-331-3p相對于U6的表達水平。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測HUVEC中MDA水平及SOD和GSH-Px活性

向HUVEC中加入細胞裂解液，充分裂解細胞，3 500 r/min離心5 min，取上清液，分別參照MDA、SOD和GSH-Px試劑盒，檢測上清液中其表達水平。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡

向各組HUVEC中加500 μL結(jié)合緩沖液，將細胞重懸。然后利用Annexin V-FITC/PI試劑盒，依次加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6Western blot檢測cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達

將各組HUVEC中加放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)試劑，充分裂解細胞，提取細胞中總蛋白。將蛋白溶液經(jīng)BCA法定量、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別置于cleaved-caspase3(1∶1 000)、cleaved-caspase9(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液，在4 ℃冰箱中孵育過夜。洗膜后置于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中，在37 ℃搖床中孵育1 h。洗膜后加顯影液避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析cleaved-caspase3和cleaved-caspase9相對于GAPDH表達水平。

1.2.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

根據(jù)Circular RNA Interactome靶基因在線軟件預測circ_0062389與miRNA-331-3p核苷酸序列的結(jié)合位點，分別構(gòu)建circ_0062389野生型熒光素酶載體(WT-circ_0062389)及突變型熒光素酶載體(MUT-circ_0062389)，該過程由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并完成。將HUVEC接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別將WT-circ_0062389和miRNA-NC、WT-circ_0062389和miRNA-331-3p mimic、MUT-circ_0062389和miRNA-NC、MUT-circ_0062389和miRNA-331-3p mimic共轉(zhuǎn)染至HUVEC中。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h收集細胞，加細胞裂解液裂解，3 500 r/min離心5 min，取上清液，參照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲與海腎熒光強度的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL組與Con組HUVEC中circ_0062389和miRNA-331-3p表達水平比較

ox-LDL組HUVEC中circ_0062389表達水平高于Con組(3.01±0.29vs.1.00±0.00，t=20.79，P<0.01)，而miRNA-331-3p表達水平低于Con組(0.33±0.03vs.1.00±0.00，t=67.00，P<0.01)。

2.2 各組HUVEC中MDA水平及SOD、GSH-Px活性比較

B組HUVEC中circ_0062389表達低于A組(0.23±0.03vs.1.00±0.00，t=77.00，P<0.01)。與Con組比較，ox-LDL組HUVEC中MDA水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)。與A組比較，B組HUVEC中MDA水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)。ox-LDL組與A組各檢測指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組HUVEC中MDA水平及SOD、GSH-Px活性比較

2.3 各組HUVEC中凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較

ox-LDL組HUVEC中細胞凋亡率高于Con組[(30.38±3.45)%vs.(5.14±0.43)%,P<0.05]，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達水平高于Con組(P<0.05)。A、B組HUVEC中細胞凋亡率分別為(32.57±3.17)%、(10.14±0.84)%，與A組比較，B組HUVEC中細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；且凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達水平均低于A組(P<0.05)。ox-LDL組與A組各檢測指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1、2。

a:P<0.05,與Con組比較；b:P<0.05，與A組比較。

2.4 Circular RNA Interactome靶基因在線軟件預測circ_0062389與miR-331-3p核苷酸序列的結(jié)合位點

Circular RNA Interactome靶基因在線軟件預測顯示，circ_0062389與miRNA-331-3p的核苷酸序列存在結(jié)合位點，見圖3。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miRNA-331-3p mimics和WT-circ_0062389的HUVEC熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染miRNA-NC和WT-circ_0062389的細胞明顯降低(0.52±0.04vs.0.96±0.07，t=16.37，P<0.01)，但共轉(zhuǎn)染miRNA-331-3p mimics和MUT-circ_0062389的HUVEC熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miRNA-NC和MUT-circ_0062389的細胞比較差異無統(tǒng)計學意義(0.99±0.07vs.0.98±0.08，t=0.28，P=0.78)。同時，轉(zhuǎn)染si-circ_0062389的HUVEC中miRNA-331-3p表達明顯高于轉(zhuǎn)染si-NC的細胞(3.01±0.28vs.1.03±0.06，t=20.74，P<0.01)。

圖2 各組HUVEC細胞凋亡流式圖

圖3 circ_0062389的序列中含有與miRNA-331-3p互補的核苷酸序列

2.5 C、D組HUVEC細胞損傷相關(guān)指標比較

D組HUVEC中miRNA-331-3p表達高于C組細胞(3.79±0.31vs.1.00±0.00，t=27.00，P<0.01)。與C組比較，D組HUVEC中MDA水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)，細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達水平均降低(P<0.05)，見表2、圖4。

A:Western blot檢測；B：蛋白相對表達水平柱狀圖；C、D：細胞凋亡流式圖；a:P<0.05,與C組比較。

表2 C、D組HUVEC細胞損傷相關(guān)指標比較

2.6 E、F組HUVEC細胞損傷相關(guān)指標比較

F組HUVEC中miRNA-331-3p表達低于E組細胞(0.26±0.02vs.1.00±0.00，t=111.00，P<0.01)。與E組比較，F(xiàn)組HUVEC中miRNA-331-3p表達水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)，細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達水平均升高(P<0.05),見圖5、表3。

A:Western blot檢測；B：蛋白相對表達水平柱狀圖；C、D：細胞凋亡流式圖；a:P<0.05,與E組比較。

表3 E、F組HUVEC細胞損傷相關(guān)指標比較

3 討 論

ox-LDL是重要的致病因子，其可誘導血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生過度氧化應(yīng)激反應(yīng)及細胞凋亡，促進AS的發(fā)生、發(fā)展過程[8]。本研究顯示，HUVEC經(jīng)100 μg/mL ox-LDL干預24 h后，細胞中氧化應(yīng)激指標MDA表達明顯增加，SOD和GSH-Px活性明顯降低，且細胞凋亡率升高，與相關(guān)報道結(jié)果一致[9]，說明ox-LDL誘導HUVEC產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，且加劇了HUVEC凋亡，ox-LDL誘導的HUVEC損傷模型建立成功。

circRNA呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可通過競爭性結(jié)合miRNA，影響miRNA靶基因的表達，進而發(fā)揮生物學功能。研究顯示，circRNA參與調(diào)控血管內(nèi)皮細胞功能障礙，可作為減輕血管內(nèi)皮細胞損傷的分子靶點。如PENG等[10]研究顯示，circ-USP36可通過靶向miRNA-98-5p/VCAM1軸促進ox-LDL誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡及炎性反應(yīng)，減輕血管內(nèi)皮細胞損傷，其有望成為治療AS的分子靶點；QIN等[11]研究顯示，circ_0003645的沉默可減輕ox-LDL誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡及炎癥損傷，對揭示AS的發(fā)病機制及治療靶點的選擇提供了新途徑。探究影響AS血管內(nèi)皮細胞損傷的分子機制可為其治療提供新靶點。

circ_0062389是circRNA家族成員之一，可靶向miRNA-103a-3p/CCNE1軸促進非小細胞肺癌的發(fā)展進程，為非小細胞肺癌的治療提供了新策略[12]。本研究結(jié)果顯示，circ_0062389在ox-LDL誘導的HUVEC中表達升高，敲減其表達可明顯減少ox-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡，提示circ_0062389可能成為降低ox-LDL誘導的HUVEC細胞損傷的分子靶點。細胞凋亡受多種基因分子調(diào)控，其中caspase級聯(lián)反應(yīng)對細胞凋亡發(fā)揮重要調(diào)控作用[13]。caspase9是caspase級聯(lián)反應(yīng)的起始分子，再接受到上游凋亡信號后被活化，向下游傳遞凋亡信號。caspase3處于caspase級聯(lián)反應(yīng)的核心位置，其被活化后，執(zhí)行細胞凋亡。本研究結(jié)果提示，circ_0062389可能通過間接抑制caspase級聯(lián)反應(yīng)來減少ox-LDL誘導的HUVEC凋亡。

ox-LDL引起的血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激是血管內(nèi)皮細胞損傷的主要通路，抑制ox-LDL誘導的氧化應(yīng)激可保護血管內(nèi)皮細胞免受氧化損傷[14]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，細胞中其水平越高，說明氧化應(yīng)激反應(yīng)越劇烈。SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，其可清除氧自由基，減輕機體組織損傷。GSH-Px也是抗氧化酶，與SOD具有協(xié)同作用，對機體組織發(fā)揮保護作用。本研究顯示，敲減circ_0062389通過降低ox-LDL誘導的HUVEC中MDA表達及提高SOD和GSH-Px活性減輕細胞氧化損傷。

為了進一步探究敲減circ_0062389抑制ox-LDL誘導的HUVEC氧化應(yīng)激和凋亡的分子機制，本研究證實了circ_0062389可靶向結(jié)合并負調(diào)控miRNA-331-3p，這與本文ox-LDL促進HUVEC中circ_0062389的表達而抑制miRNA-331-3p表達的結(jié)果一致。有研究顯示，miRNA-331-3p在阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)患者血清中表達降低，且與AD患者簡易智能精神狀態(tài)量表(mini-mental state examination,MMSE)評分和血清促炎細胞因子的表達密切相關(guān)，是診斷AD的潛在生物標志物；過表達miRNA-331-3p可提高β-淀粉樣蛋白(amyloid beta,Aβ)1-40誘導的神經(jīng)母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞活性，并抑制細胞炎性損傷，miRNA-331-3p具有潛在的神經(jīng)保護作用[15]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-331-3p過表達明顯減輕了ox-LDL誘導的HUVEC氧化應(yīng)激水平，并減少了細胞凋亡，提示miRNA-331-3p可作為AS治療的分子靶點。此外，本研究實驗結(jié)果還顯示，敲減miRNA-331-3p逆轉(zhuǎn)敲減circ_0062389對ox-LDL誘導的HUVEC氧化應(yīng)激及凋亡的抑制作用，進一步提示circ_0062389可能通過靶向負調(diào)控miRNA-331-3p來影響ox-LDL誘導的HUVEC氧化應(yīng)激和凋亡，但其具體調(diào)控的miRNA-331-3p靶基因還有待進一步探究。

綜上所述，ox-LDL促進HUVEC中circ_0062389的表達，而抑制miRNA-331-3p表達；circ_0062389可能通過靶向抑制miRNA-331-3p來促進ox-LDL誘導的HUVEC氧化應(yīng)激及凋亡，其可能成為AS治療的分子靶點。