安 慶，惠 坤，朱東寧

(1.西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院皮膚科,西安 710018；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科,西安 710003；3.西北婦女兒童醫(yī)院皮膚科,西安 710061)

皮膚是保護(hù)人體免受有毒化學(xué)物質(zhì)污染和紫外線輻射的第一道防線[1]。中波紫外線(ultraviolet B，UVB，280～320 nm)能夠穿透表皮到達(dá)真皮上層，造成皮膚DNA和氧化應(yīng)激損傷[2-3]。此外，UVB輻射能夠提高皮膚光老化和致癌風(fēng)險(xiǎn)[4]。研究顯示，微RNA(microRNA，miRNA)是19～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可參與調(diào)控UVB造成的皮膚細(xì)胞損傷過(guò)程[5]。胡翠等[6]研究顯示，miRNA-1246靶向抑制絲裂原活化蛋白激酶14參與調(diào)控皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性。毛麗艷等[7]研究報(bào)道，miRNA-26a靶向調(diào)控組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶2調(diào)控長(zhǎng)波紫外線(ultraviolet A,UVA)照射誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性，影響細(xì)胞光老化。有研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚成纖維細(xì)胞中，miRNA-217過(guò)度表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞衰老[8]。沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1(silent information transcription regulator 1，Sirt1)/叉形頭轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead transcription factor 1，F(xiàn)OXO1)途徑與細(xì)胞氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)[9]，但miRNA-217與人皮膚成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblasts，HFF)的UVB輻射損傷及其與Sirt1/FOXO1關(guān)系尚不清楚。本研究擬通過(guò)UVB損傷HFF-1模型，探討miRNA-217對(duì)HFF-1細(xì)胞損傷的影響機(jī)制，為臨床預(yù)防皮膚疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1主要材料

HFF-1(SCSP-109)來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)液(11995)、細(xì)胞凋亡試劑盒(CA1020)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT，BC0200)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，BC0170)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，BC0025)試劑盒、胎牛血清(11011-6123)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8，CA1210)、放射免疫沉淀試驗(yàn)(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(R0010)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(T2210-200T)均購(gòu)自北京索萊寶有限公司；miRNA-217 抑制劑、miRNA-217 陰性對(duì)照(negative control，NC)由廣州銳博生物生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)；2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorescein yellow diacetate，DCHF-DA，D399)、Sirt1(PA5-17074)和FOXO1(82358)兔抗人多克隆抗體、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin，MII0201)小鼠抗人單克隆抗體、山羊抗兔(A32731)和山羊抗小鼠lgG(H+L)二級(jí)抗體(A32723)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2主要儀器

HF160W型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自上海Heal Force公司；EVOS M5000細(xì)胞成像系統(tǒng)、ProFlex型PCR儀(ProFlex)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；WD-9413C型凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海添時(shí)科學(xué)儀器有限公司；ELX-8081U型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

將HFF-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%(V/V)胎牛血清、1%(V/V)雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%(V/V)CO2環(huán)境中培養(yǎng)至3～5代，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2UVB照射及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[10]方法照射HFF-1細(xì)胞1、2、3、4 d后設(shè)置為UVB組，另取HFF-1細(xì)胞作為正常組。根據(jù)RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR擴(kuò)增后，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-217相對(duì)表達(dá)水平。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火，延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。miRNA-217和U6由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。

表1 miRNA-217和U6引物序列

1.2.3細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

將HFF-1細(xì)胞分為對(duì)照組、miRNA-217 NC組和miRNA-217 抑制劑組，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明轉(zhuǎn)染miRNA-217 NC組和miRNA-217 抑制劑組，12 h后更換為新鮮培養(yǎng)液孵育6 h，參照1.2.2對(duì)各組進(jìn)行連續(xù)3 d的UVB照射，并檢測(cè)miRNA-217表達(dá)水平。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于96孔板(5.0×104個(gè)/孔)，分組處理后，按照CCK-8說(shuō)明書(shū)測(cè)量各孔吸光值(A)，計(jì)算細(xì)胞活力(%)。細(xì)胞活力(%)=[A(轉(zhuǎn)染)-A(調(diào)零孔)]/[A(未轉(zhuǎn)染)-A(調(diào)零)]×100%。

1.2.5凋亡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)處理1.2.3各組細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡變化，計(jì)算凋亡率。凋亡率=凋亡早期細(xì)胞比例+凋亡晚期細(xì)胞比例。

1.2.6活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)

將各組細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽溶液清洗后，加入DCHF-DA探針，避光保存15 min，無(wú)血清培養(yǎng)基清洗后，熒光顯微鏡下(λEx=488 nm，λEm=525 nm)觀察并記錄。

1.2.7CAT、SOD和MDA檢測(cè)

根據(jù)CAT、SOD和MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，檢測(cè)各組上述指標(biāo)水平。

1.2.8Western blot檢測(cè)

RIPA提取總蛋白，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測(cè)蛋白總濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h后，加入一抗Sirt1、乙?；疐OXO1(Ac-FOXO1)、FOXO1和β-actin(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，加入二抗(1∶10 000)，曝光顯影，分析條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 UVB照射后miRNA-217表達(dá)變化

與正常組比較，相同時(shí)間時(shí)，UVB組miRNA-217表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與UVB組照射1 d比較，UVB組照射2、3、4 d后細(xì)胞中miRNA-217表達(dá)水平依次升高(P<0.05)。因3、4 d增幅縮小，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故選取UVB照射3 d進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞miRNA-217表達(dá)水平比較，見(jiàn)表2。

表2 正常組與UBV組細(xì)胞miRNA-217表達(dá)水平比較

2.2 轉(zhuǎn)染后UVB誘導(dǎo)的HFF-1細(xì)胞miRNA-217表達(dá)水平

與正常組比較，對(duì)照組miRNA-217表達(dá)水平明顯升高(1.03±0.08vs.2.52±0.08，P<0.05)；與對(duì)照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組miRNA-217表達(dá)水平明顯降低(2.52±0.08vs.1.14±0.03，2.48±0.07vs.1.14±0.03，P<0.05)。

2.3 各組HFF1細(xì)胞存活率比較

與正常組比較，對(duì)照組細(xì)胞存活率明顯降低[(100.00±5.23)%vs.(51.29±3.46)%，P<0.05]；與對(duì)照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組細(xì)胞存活率明顯升高[(51.29±3.46)%vs.(83.94±3.91)%，(48.73±4.82)%vs.(83.94±3.91)%，P<0.05]。

2.4 各組HFF1細(xì)胞凋亡率比較

與正常組比較，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯升高[(2.06±0.68)%vs.(13.86±1.14)%，P<0.05]；與對(duì)照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組細(xì)胞凋亡率明顯降低[(13.86±1.14)%vs.(3.13±0.95)%，(12.56±1.70)%vs.(3.13±0.95)%，P<0.05]；對(duì)照組與miRNA-217 NC組細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HFF1細(xì)胞凋亡情況

2.5 各組HFF1細(xì)胞ROS水平比較

與正常組比較，對(duì)照組HFF-1細(xì)胞中ROS水平明顯升高(P<0.05)；與對(duì)照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組HFF-1細(xì)胞中ROS水平明顯降低(P<0.05)；對(duì)照組與miRNA-217 NC組ROS水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。熒光顯微鏡下觀察各組HFF-1細(xì)胞ROS水平，見(jiàn)圖2。

圖2 熒光顯微鏡下觀察各組HFF-1細(xì)胞ROS水平(綠色熒光代表ROS水平，×200)

2.6 各組HFF-1細(xì)胞CAT、SOD和MDA水平比較

與正常組比較，對(duì)照組細(xì)胞CAT和SOD活性明顯降低(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)；與對(duì)照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組細(xì)胞CAT和SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA水平明顯降低(P<0.05)；對(duì)照組與miRNA-217 NC組上述指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組HFF-1細(xì)胞CAT、SOD活性和MDA水平比較

2.7 各組HFF1細(xì)胞Sirt1、Ac-FOXO1和FOXO1表達(dá)水平比較

與正常組比較，對(duì)照組HFF-1細(xì)胞Sirt1和FOXO1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Ac-FOXO1蛋白表達(dá)和Ac-FOXO1/FOXO1比值明顯升高(P<0.05)；與對(duì)照組和miRNA-217 NC組比較，miRNA-217 抑制劑組HFF-1細(xì)胞Sirt1和FOXO1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Ac-FOXO1蛋白表達(dá)和Ac-FOXO1/FOXO1比值明顯降低(P<0.05)；對(duì)照組與miRNA-217 NC組上述指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3，表4。

A：正常組；B：對(duì)照組；C：miRNA-217 NC組；D：miRNA-217抑制劑組。

表4 各組HFF1細(xì)胞Sirt1、Ac-FOXO1和FOXO1蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

紫外線長(zhǎng)時(shí)間照射是引起皮膚損傷的主要因素之一，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在皮膚細(xì)胞代謝、衰老、癌變中起著至關(guān)重要的作用。miRNA-186-5p通過(guò)抑制Twist相關(guān)蛋白1蛋白表達(dá)誘導(dǎo)HFF1衰老，miRNA-186-5p可能是干預(yù)皮膚老化的潛在靶點(diǎn)[11]。miRNA-22-3p在皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中低表達(dá)，其過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)控結(jié)構(gòu)蛋白家族1蛋白表達(dá)致癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[12]。吳林燕等[13]研究顯示，miRNA-217在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，抑制miRNA-217調(diào)控DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1蛋白表達(dá)可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，隨UVB照射時(shí)間的延長(zhǎng)，HFF-1細(xì)胞中miRNA-217表達(dá)逐漸增加，與文獻(xiàn)[6]研究結(jié)果一致，提示UVB照射后HFF-1細(xì)胞中miRNA-217異常高表達(dá)。與正常組比較，對(duì)照組細(xì)胞中miRNA-217表達(dá)明顯升高，細(xì)胞存活率明顯降低，凋亡率明顯升高。提示UVB長(zhǎng)時(shí)間照射后引起HFF-1細(xì)胞損傷且可能與細(xì)胞中miRNA-217異常表達(dá)有關(guān)。

UVB長(zhǎng)時(shí)間照射造成皮膚細(xì)胞損傷與皮膚抗氧化系統(tǒng)紊亂有關(guān)。ROS參與機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，UVB引起皮膚細(xì)胞損傷后ROS分泌水平增加，清除率低[14]。抗氧化酶CAT和SOD為細(xì)胞抗氧化防御體系的重要物質(zhì)，對(duì)機(jī)體氧化動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要[15]。MDA是細(xì)胞氧化程度和受損的重要標(biāo)志[16]。有研究顯示，提高皮膚組織中SOD、CAT的活力，降低MDA水平、清除ROS可有效地減輕紫外線照射引起的皮膚損傷[17]。miRNA-217在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中被明顯上調(diào)[18]。在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中，阻斷miRNA-217表達(dá)可以減輕高糖對(duì)足細(xì)胞活力不利作用，并抑制ROS水平和細(xì)胞凋亡，從而拮抗細(xì)胞損傷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-217 抑制劑干預(yù)后，HFF-1細(xì)胞存活率及CAT、SOD活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率、MDA水平明顯降低，提示下調(diào)miRNA-217能夠提高UVB誘導(dǎo)下HFF-1細(xì)胞的抗氧化能力。

Sirt1是一種組蛋白脫乙?；?，能夠促進(jìn)FOXO1脫乙酰化發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[20]。MO等[21]研究發(fā)現(xiàn)，使用Sirt1激活劑能夠促進(jìn)FOXO1核表達(dá)，逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)的鼠胰島細(xì)胞氧化損傷；在低密度脂蛋白引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中，激活Sirt1/FOXO1可以提高細(xì)胞的抗氧化能力[22]。此外，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，心肌缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞或心臟中Sirt1上調(diào)，F(xiàn)OXO1乙?；抡{(diào)有利于抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-217 抑制劑干預(yù)后，Sirt1/FOXO1通路被激活，Ac-FOXO1水平明顯降低，提示下調(diào)miRNA-217可能通過(guò)激活Sirt1/FOXO1途徑，抑制UVB誘導(dǎo)的HFF-1細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。MENGHINI等[24]證實(shí)，miRNA-217能夠靶向促進(jìn)Sirt1表達(dá)，降低FOXO1乙?；?，抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老，因此，推測(cè)下調(diào)miRNA-217水平可能通過(guò)靶向促進(jìn)Sirt1蛋白表達(dá)，抑制FOXO1乙?；?，減輕UVB誘導(dǎo)所致HFF-1細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，下調(diào)miRNA-217可抑制UVB誘導(dǎo)的HFF-1細(xì)胞凋亡，降低氧化應(yīng)激，這可能與激活Sirt1/FOXO1信號(hào)通路相關(guān)，表明miRNA-217可能是預(yù)防UVB引起的皮膚疾病的潛在靶標(biāo)。然而，光損傷作為皮膚病的主要環(huán)境因素，其機(jī)制復(fù)雜，因此，仍需進(jìn)一步聯(lián)合動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)進(jìn)行探討。