潘延斌,蘇家光,譚美樂,楊 猛,覃文飛,黃榆秀,蒙世豪,黃耀輝,梁堅(jiān)強(qiáng),蘇雪芳,黃姿嬋,李建民

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科，廣西 南寧 530031；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，廣西 南寧 530021）

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，其主要病理特征為角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖、細(xì)胞周期縮短和細(xì)胞對凋亡信號(hào)的抵抗性增加等［1］。銀屑病在人群中具有較高的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量［2］。但迄今為止銀屑病的病因及其分子機(jī)制尚不清楚，這導(dǎo)致臨床現(xiàn)有的治療手段均不理想。因此積極探討細(xì)胞增殖/凋亡失衡和異常細(xì)胞周期進(jìn)展的分子機(jī)制對更好地認(rèn)識(shí)銀屑病的致病機(jī)制有至關(guān)重要的作用。

近年來隨著對銀屑病研究［3］的深入，人們發(fā)現(xiàn)DNA甲基化異常在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。而DNA甲基化需要在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的催化下進(jìn)行特定的化學(xué)修飾以完成目的基因的甲基化修飾，從而調(diào)控后者的表達(dá)及功能［4］。既往研究［5］顯示：在銀屑病患者皮損組織中存在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3a（DNA methyltransferase 3a，DNMT 3a）異常高表達(dá)現(xiàn)象，提示銀屑病表皮中存在某些基因的甲基化水平異常。Yes-相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo信號(hào)通路中一個(gè)關(guān)鍵組分，研究［6］顯示：YAP在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和組織生長發(fā)育等細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程中具有重要作用。最近有研究［7］顯示：在銀屑病患者皮損組織中YAP蛋白的表達(dá)異常增加，同時(shí)沉默YAP在角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT中的表達(dá)能夠通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)展來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖/凋亡的失衡現(xiàn)象。大腫瘤抑制基因1（large tumor suppressor gene 1，LATS1）同樣也是Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，作為YAP蛋白的上游基因，其被證實(shí)能夠在體內(nèi)外調(diào)控YAP基因的轉(zhuǎn)錄并抑制YAP蛋白介導(dǎo)的促增殖作用［8］。然而，LAST 1基因啟動(dòng)子區(qū)存在大量可發(fā)生甲基化的Cp G島，因此LAST 1基因極易發(fā)生甲基化而失活，進(jìn)而失去對YAP基因的抑制作用［9］。然而，尚無相關(guān)研究顯示在銀屑病中DNMT 3a是否是通過改變LAST 1啟動(dòng)區(qū)甲基化水平而減弱其對YAP基因的表達(dá)抑制作用，從而導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和凋亡的失衡。本研究檢測銀屑病患者皮損組織中DNMT 3a的表達(dá)和LAST 1的甲基化水平，并在體外誘導(dǎo)建立銀屑病樣細(xì)胞模型以明確DNMT 3a與LAST 1/YAP信號(hào)通路之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年5月—2019年5月于廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科就診的15例尋常型銀屑病患者的斑塊樣皮損組織作為銀屑病組，其中男性9例，女性6例，平均年齡18～49歲。另于廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科和整形外科收集年齡和性別相匹配的15名研究對象的健康皮膚組織作為對照組。15例銀屑病患者的銀屑病皮損 程 度（psoriasis area and severity index，PASI）評分為2.7～44.6分，皮損組織取材于四肢近端伸側(cè)或軀干部位。所有受試者均為本地長期居住人群。納入標(biāo)準(zhǔn)：①銀屑病組患者均符合銀屑病臨床和病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，病程均＞3個(gè)月，且1個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)用藥，2周內(nèi)未使用外用藥物。②所有受試者均未并發(fā)其他系統(tǒng)如心腦血管、呼吸、消化和免疫等相關(guān)疾病及腫瘤，排除妊娠及哺乳者；③所有受試者病史資料完善，且自愿參加本實(shí)驗(yàn)，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT購自中科院上海細(xì)胞所。DMEM培養(yǎng)液、Opti-MEM培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Gibico公司），含EDTA的0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司），CCK-8試劑（美國Sigma公司），TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA試劑盒和EdU試劑盒（美國Thermo公司），SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（上海索萊寶生物公司），轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine3000（美國Invitrogen公司），含沉默DNMT 3a的siRNA（si-DNMT 3a）和siRNA陰性對照序列（si-NC）質(zhì)粒（廣州銳博生物公司），PCR和甲基化特異性PCR（methy lation specific PCR，MSP）引物（上海生工公司），DNA提取試劑盒（美國Tiangen生物公司），甲基化試劑盒（美國Zymo Research公司），AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（江蘇碧云天公司），細(xì)胞周期檢測試劑盒（美國BD公司），MSP相關(guān)試劑（日本TaKaRa公司），兔抗DNMT 3a、LATS1、YAP1和β-actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗Cyclin D1、CDK6、cleaved caspase-3單克隆抗體（美國Abcam公司），HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物有限公司）。流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司），超凈工作臺(tái)（美國Thermo公司），PCR儀、RT-qPCR儀和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 皮膚組織標(biāo)本處理采用0.25%分散酶消化上述收集的皮膚組織標(biāo)本14～20 h以完全分離表皮組織，取約3 mL含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化上述分離的皮膚組織后，在研磨器中進(jìn)行組織勻漿以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組常規(guī)復(fù)蘇HaCaT細(xì)胞后采用含10%FBS和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取生長匯合至80%的HaCaT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/孔，接種至6孔板中培養(yǎng)過夜，次日參考轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine3000說明書，將 50 ng si-DNMT 3a或si-NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入HaCaT細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含10%FBS的DMEM常規(guī)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后更換為含2 mg·L－1嘌呤霉素篩選細(xì)胞，以建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。參考文獻(xiàn)［10］，采用M 5培養(yǎng)法誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞48 h后，建立銀屑病樣HaCaT細(xì)胞模型。按處理?xiàng)l件的不同將HaCaT細(xì)胞分為：M 5培養(yǎng)誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞（對照組）、采用M 5培養(yǎng)誘導(dǎo)的經(jīng)轉(zhuǎn)染si-DNMT 3a質(zhì)粒的HaCaT細(xì)胞（si-DNMT 3a組）、采用M 5培養(yǎng)誘導(dǎo)的經(jīng)轉(zhuǎn)染si-NC質(zhì)粒的HaCaT細(xì)胞（si-NC組）和正常培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞（HaCaT組）。將上述各組細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，若無特殊說明，取培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RT-qPCR法檢測2組研究對象表皮組織細(xì)胞中DNMT 3a m RNA表達(dá)水平按照TRIzol法提取表皮組織和各組細(xì)胞中的總RNA，分光光度計(jì)檢測RNA純度和濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBR Green Real-time PCR試劑說明書和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的反應(yīng)時(shí)間及溫度進(jìn)行RT-qPCR。RT-qPCR引物序列：DNMT 3a上游引物 5′-GGACAAGAATGCCACCAAATCA-3′，DNMT 3a下 游 引 物5′-CTTGCCGTCTCCGAACCA-3′；GAPDH上 游 引 物5′-CAAATTCATTGTCGTACCAG-3′，下 游 引 物5′-ACACTCACTCTTCTACCTTTG-3′。以GADPH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法分析目的基因的表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.6 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖率取上述各組細(xì)胞，常規(guī)消化細(xì)胞后接種至96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104個(gè)/孔，并向每孔加入200μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)過夜后，分別于12、24、36和48 h時(shí)向每孔加入10μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育2 h后，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測每孔吸光度（A）值，每個(gè)濃度每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組A值－對照組A值）/對照組A值×100%。繪制各組細(xì)胞的生長曲線。

1.7 Ed U染色檢測各組細(xì)胞增殖率取上述各組細(xì)胞，接種至鋪有蓋玻片的24孔板中，每孔加入1 mL含10%FBS和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照試劑盒說明書檢測培養(yǎng)48 h的細(xì)胞增殖率。在離觀察終點(diǎn)2 h前向培養(yǎng)基中加入終濃度為50μmol·L－1的Ed U溶液，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，每孔加入200μL Apollo染色反應(yīng)液避光孵育30 min，加入Hoechst3342作用30 min，置于熒光顯微鏡下采用550 nm的激發(fā)光觀察Appolo567染色，采用350 nm的激發(fā)光觀察Hoechst3342染色，最后拍照計(jì)算細(xì)胞核（Hoechst）與增殖細(xì)胞（Appolo）染色的細(xì)胞數(shù)，Appolo/Hoechst比值的百分率為Edu陽性表達(dá)率，以此代表細(xì)胞增殖率。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同細(xì)胞周期各組細(xì)胞百分率取上述各組細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS輕輕洗滌細(xì)胞后，進(jìn)行常規(guī)消化，300 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，加入500μL PBS重懸細(xì)胞，并迅速加入3.5 mL－20℃預(yù)冷的70%酒精，將細(xì)胞吹打均勻后，于4℃固定過夜。PBS洗滌細(xì)胞3次，按上述方法離心后以充分去除固定液，隨后按照細(xì)胞周期流式檢測試劑盒的說明方法進(jìn)行操作，加入500μL PI/RNase染色液，4℃條件下避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同細(xì)胞周期各組細(xì)胞百分率。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.9 AnnexinⅤ-FITC法檢測各組細(xì)胞凋亡率取上述各組細(xì)胞，800 g離心5 min，棄上清，4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，再次離心后，收集細(xì)胞沉淀，采用195μL AnnexinⅤ-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞至7×105mL－1。并依次加入5μL AnnexinⅤ-FITC和10μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液，輕輕搖晃離心管以充分混勻后，室溫下避光孵育30 min。300目濾膜過濾細(xì)胞團(tuán)塊后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.10 MSP法檢測各組細(xì)胞中LATS1基因的甲基化水平按照DNA提取試劑盒說明書方法提取銀屑病組患者皮損組織和對照組研究對象表皮組織的基因組DNA，紫外分光光度計(jì)檢測DNA的純度和濃度后，按照甲基化試劑盒說明書方法進(jìn)行基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾。MSP引物：LATS1甲基化上游引物5′-GAACGATAAGAGTTGCGGGCGCC-3′，LATS1甲基化下游引物5′-AACAATTCCCGACGTCGCTTTCG-3′；LATS1非甲基化上 游 引 物L(fēng)ATS1 5′-TGATTGATTAGAGTCGTGGGTGAT-3′，LATS1非甲基化下游引物5′-AATCATTTCCCAACATCATTTACA-3′。取擴(kuò)增產(chǎn)物于含EB的2%瓊脂糖凝膠中電泳。采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用甲基化引物擴(kuò)增出產(chǎn)物則表示待測基因組存在DNA甲基化，若采用非甲基化引物擴(kuò)增出產(chǎn)物則表示不存在DNA甲基化，若均擴(kuò)增出產(chǎn)物即為部分甲基化。采用PyroMark Q48-CpG軟件自動(dòng)分析2組研究對象表皮組織中LATS1基因每個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平。

1.11 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)水平取上述各組細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入RIPA細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑進(jìn)行提取細(xì)胞中總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量。取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后，分別加入DNMT 3a（1∶300）、LATS1（1∶300）、YAP1（1∶300）、Cyclin D1（1∶500）、CDK6（1∶500）、cleaved caspase-3（1∶500）和β-actin（1∶1 000）一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，每次5 min，以辣根酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，以TBST溶液清洗3次，每次5 min。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀曝光拍照。采用Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin條帶灰度值。以上實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組研究對象皮膚組織中DNMT 3a mRNA表達(dá)水平，各組細(xì)胞中DNMT 3a mRNA和蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞增殖率，Ed U陽性表達(dá)率，不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中LATS1、YAP1、Cyclin D1、CDK6和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)。2組研究對象皮膚組織中LATS1基因的甲基化水平以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組研究對象皮膚組織中DNMT 3a m RNA表達(dá)水平與對照組比較，銀屑病組患者皮膚組織中DNMT 3a mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 RT-qPCR法檢測對照組和銀屑病組研究對象皮膚組織中DNMT 3a mRNA表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of DNMT 3a mRNA in epidermal tissue of subjects in control group and psoriasis group detected by RT-qPCR method

2.2 各組HaCaT細(xì)胞中DNMT 3a mRNA表達(dá)水平與HaCaT組比較，si-NC組HaCaT細(xì)胞中DNMT 3a mRNA表 達(dá) 水 平 降 低（P＜0.05），si-DNMT 3a組HaCaT細(xì)胞中DNMT 3a mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 RT-qPCR法檢測各組HaCaT細(xì)胞中DNMT 3a mRNA表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of DNMT 3a mRNA in HaCaT cells in various groups detected by RT-qPCR method

2.3 各組HaCaT細(xì)胞增殖率和Ed U陽性率與HaCaT組比較，對照組、si-NC組和si-DNMT 3a組HaCaT細(xì)胞增殖率隨時(shí)間的延長而不斷增加，其中以48 h時(shí)HaCaT細(xì)胞增殖率升高最為明顯（P＜0.01）；與對照組和si-NC組比較，si-DNMT 3a組HaCaT細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）。見圖3。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與HaCaT組（21.05%±7.06%）比較，對照組（82.24%±16.10%）、si-NC組（75.39%±15.42%）和si-DNMT 3a組（58.11%±13.79%）HaCaT細(xì)胞中Ed U陽性率明顯升高（P＜0.05），而si-DNMT 3a組HaCaT細(xì)胞中Ed U陽性率明顯低于對照組和si-NC組（P＜0.05）。見圖4。

圖3 CCK-8法檢測各組HaCaT細(xì)胞增殖率Fig.3 Proliferation rates of HaCaT cells in various groups detected by CCK-8 method

圖4 Ed U染色法檢測各組HaCaT細(xì)胞的增殖活力（×200）Fig.4 Proliferation activities of HaCaT cells in various groups detected by EdU staining(×200)

2.4 不同細(xì)胞周期各組HaCaT細(xì)胞百分率與HaCaT組比較，對照組、si-NC組和si-DNMT 3a組G1期HaCaT細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.05），S期HaCaT細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.01）；與對照組和si-NC組比較，si-DNMT 3a組G1期HaCaT細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.05），但S期HaCaT細(xì)胞百分率降低（P＜0.05）。見圖5和6。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同細(xì)胞周期各組HaCaT細(xì)胞百分率Fig.5 Percentages of HaCaT cells at different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

2.5 各組HaCaT細(xì)胞凋亡率對照組、si-NC組和si-DNMT 3a組HaCaT細(xì)胞凋亡率分別為（10.18±4.26）%、（2.71±0.62）%、（3.16±0.89）%和（5.48±1.23）%。與HaCaT組比較，對照組、si-NC組和si-DNMT 3a組HaCaT細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與對照組和si-NC組細(xì)胞比較，si-DNMT 3a組HaCaT細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HaCaT細(xì)胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of HaCaT cells in various groups detected by flow cytometry

圖6 不同細(xì)胞周期各組HaCaT細(xì)胞百分率Fig.6 Percentages of HaCaT cells at different cell cycles in various groups

2.6 2組研究對象皮膚組織中LAST 1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平MSP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對照組［6.7%（1/15）］比較，銀屑病組患者皮膚組織中LAST 1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平［33.3%（5/15）］明顯升高（P＜0.01）。見圖8。

圖8 MSP法檢測2組研究對象皮膚組織中LAST 1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平Fig.8 Methylation levels of LAST 1 promoter in epidermal tissue of subjects in two groups detected by MSP method

2.7 各組HaCaT細(xì)胞中DNMT 3a蛋白和LAST 1/YAP信號(hào)通路及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平與HaCaT組比較，對照組和si-NC組HaCaT細(xì)胞中DNMT 3a蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），si-DNMT 3a組HaCaT細(xì)胞中DNMT 3a蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與HaCaT組比較，對照組、si-NC組和si-DNMT 3a組HaCaT細(xì)胞中YAP1蛋白和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1及CDK6表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），LATS1蛋白和凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與對照組和si-NC組比較，si-DNMT 3a組HaCaT細(xì)胞中YAP1、Cyclin D1和CDK6蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），LATS1及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖9。

圖9 Western blotting法檢測各組HaCaT細(xì)胞中LAST 1/YAP信號(hào)通路和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A)和直條圖（B)Fig.9 Elctrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of LAST 1/YAP signaling pathway and cycle-related proteins and apoptosis-related proteins of HaCaT cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

銀屑病中角質(zhì)形成細(xì)胞具有類似腫瘤細(xì)胞的增殖過度、細(xì)胞周期縮短和抗凋亡信號(hào)等惡性細(xì)胞特性［11］。近年來，腫瘤相關(guān)調(diào)控因子和分子信號(hào)通路在銀屑病中作用的研究引起了廣泛關(guān)注。Hippo信號(hào)通路最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，但隨著研究的深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)這條高度保守的信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物生長發(fā)育過程中同樣起關(guān)鍵作用，如Hippo信號(hào)通路能夠精確調(diào)控器官的發(fā)育和組織再生，該通路的異常將導(dǎo)致細(xì)胞增殖活躍，凋亡水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致器官或組織的過度生長［12-13］。LATS1基因作為Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)因子，在正常生理狀態(tài)下，上游信號(hào)激活并磷酸化LATS1，并形成以其為中心的1個(gè)復(fù)合體，繼而磷酸化下游靶基因YAP（主要為YAP1），磷酸化的YAP1被滯留于胞漿中，從而阻滯了YAP1/TEAs信號(hào)的傳導(dǎo)［8］。當(dāng)LAST 1基因缺失或低表達(dá)時(shí)，無法繼維持YAP1的續(xù)磷酸化狀態(tài)，而未磷酸化的YAP1能夠被順利轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，與TEAs元件結(jié)合后啟動(dòng)促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活的基因表達(dá)［12］，表明Hippo信號(hào)通路主要通過LATS1的激活來抑制YAP的表達(dá)，使其磷酸化而不能傳導(dǎo)相關(guān)信號(hào)的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞及組織的生長發(fā)育。研究［9］顯示：LATS1的突變或失活主要是由其基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化造成，如在腎癌和肝癌等腫瘤組織中均出現(xiàn)LATS1的高甲基化水平。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，近年來研究［3，14］顯示：銀屑病中存在大量基因甲基化水平的改變。如ZHANG等［15］采用甲基化DNA免疫沉淀測序結(jié)果顯示：與銀屑病患者非皮損處組織比較，皮損組織中幾乎全基因組的甲基化水平均發(fā)生明顯改變，其中以TIMP2和PDCD5的甲基化程度最為明顯。經(jīng)治療后，皮損組織中DNA甲基化模式發(fā)生逆轉(zhuǎn)，即出現(xiàn)去甲基化改變，說明DNA甲基化影響銀屑病的發(fā)生發(fā)展。DNMTs是DNA甲基化過程中起重要調(diào)控作用的酶，其能夠?qū)-腺苷甲硫氨酸提供的甲基以共價(jià)結(jié)合的方式轉(zhuǎn)移至目的基因胞嘧啶的第5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶。在哺乳動(dòng)物中DNMTs主要 包括DNMT 1、DNMT 3a和DNMT 3b［16-18］。在銀屑病中，研究者［19］發(fā)現(xiàn)：DNMT 3a在皮損組織中的表達(dá)明顯增加，而這與銀屑病中存在大量的基因甲基化水平異常的現(xiàn)象高度相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：沉默DNMT 3a能明顯降低HaCaT細(xì)胞的增殖，抑制HaCaT細(xì)胞周期進(jìn)展并促進(jìn)其發(fā)生凋亡。MSP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：銀屑病皮損組織中LATS1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平較正常健康人群明顯升高，且Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)：在HaCaT細(xì)胞中LATS1蛋白表達(dá)水平較正常培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞明顯降低，而沉默DNMT 3a后HaCaT細(xì)胞中LATS1蛋白表達(dá)水平明顯升高，YAP1蛋白表達(dá)水平卻明顯降低，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和CDK6表達(dá)水平也隨之降低，但凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達(dá)水平明顯升高。YAP1作為Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，其在多種腫瘤中被視為癌基因，下調(diào)YAP1的表達(dá)能夠抑制胰腺癌、肝癌、前列腺癌和骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞的增殖，因此也被認(rèn)為是這些腫瘤的潛在治 療 靶 點(diǎn)［20-23］。而 最 新的 研 究［7，10］同 樣 證 實(shí)：在銀屑病皮損組織中異常增加的YAP1蛋白同樣能夠促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，細(xì)胞周期進(jìn)展，并抑制其凋亡，而該研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)丹參素能夠通過下調(diào)銀屑病樣細(xì)胞中YAP1的表達(dá)，從而抑制其上述作用。

綜上所述，沉默在銀屑病皮損組織中高表達(dá)的甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT 3a，可能通過降低LATS1的甲基化水平以下調(diào)YAP1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)甲基化在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的作用，并為LATS1/YAP信號(hào)通路作為銀屑病治療的潛在靶點(diǎn)提供了依據(jù)。