趙 遠(yuǎn),賈慧建,宋順佳,李 琦,邵學(xué)超,艾金霞,孫麗媛

（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

熊膽粉為脊索動(dòng)物門哺乳綱熊科動(dòng)物黑熊（Selenarctos thibetanus G.Cuvier）或棕熊（Ursus arctos Linnaeus）經(jīng)膽囊術(shù)引流膽汁后干燥而得［1］，其中含其他中藥、動(dòng)物膽汁和人工合成品不能替代的獨(dú)有成分熊去氧膽酸［2］。研究［3-5］顯示：熊膽粉對(duì)治療中樞神經(jīng)、肝膽、眼和肛腸等部位疾病有較好療效。國家食品藥品監(jiān)督管理局審批的含熊膽粉成分的中藥制劑有243種，中醫(yī)的經(jīng)典處方中有396方包含熊膽，以熊膽為原料的單味制劑熊膽膠囊收錄于《中國藥典》［6］。

熊膽入藥歷史長達(dá)百年，應(yīng)用廣泛需求量大，因來源稀缺和市場(chǎng)價(jià)格昂貴，故有不法商家借機(jī)將廉價(jià)易得的豬、牛膽汁加工成粉后，混入或冒充熊膽粉出售，以期謀取暴利。紹興“4.18”非法生產(chǎn)銷售“熊膽粉”假藥案，總涉案金額高達(dá)1億多元，不僅侵犯了消費(fèi)者權(quán)益，也極大地影響了臨床療效。既往對(duì)于熊膽粉的鑒別，傳統(tǒng)法主要采取口嘗、手搓、火燒和水試等方法［7］，受鑒別人員技術(shù)能力和經(jīng)驗(yàn)影響較大，難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化；之后又以熊去氧膽酸作為檢測(cè)指標(biāo)，采用紅外光譜測(cè)定法［8］、薄 層 色譜 鑒 別 法［9］和高 效 液 相色 譜 法［10-11］等技術(shù)鑒別，但此類方法檢測(cè)指標(biāo)單一且需大型精密儀器，檢測(cè)成本高、耗時(shí)長。隨著分子生物學(xué)方法的進(jìn)步，位點(diǎn)特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）鑒別［12］、DNA條形碼分子鑒定［13］、PCR-限制性內(nèi)切酶酶切長度多態(tài)性［14］和熒光PCR［15-16］等分子生物學(xué)鑒別方法陸續(xù)應(yīng)用于膽類藥材鑒別，但均難以一次實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)多種膽類同時(shí)檢測(cè)。故亟需建立一種針對(duì)性鑒別熊膽粉摻偽的準(zhǔn)確、快速且便捷的檢測(cè)體系。

本研究根據(jù)豬、牛和熊線粒體細(xì)胞色素b基因設(shè)計(jì)物種特異性引物，根據(jù)不同長度的擴(kuò)增片段進(jìn)行鑒定；在物種屬特異性PCR體系基礎(chǔ)上建立并優(yōu)化多重PCR體系，達(dá)到不同物種混合樣品核酸片段同時(shí)擴(kuò)增鑒定的目的。本課題組建立的多重PCR方法可同時(shí)檢測(cè)多種DNA，具有高效、經(jīng)濟(jì)和簡便等優(yōu)點(diǎn)，便于基層實(shí)施快速檢測(cè)，適用于常見的熊膽粉摻偽豬膽粉及牛膽粉的鑒別，為我國膽類藥材市場(chǎng)監(jiān)管提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品、主要試劑和儀器

熊膽粉購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái)，樣品編號(hào)為D027550，豬膽粉和牛膽粉均由吉林省長春市食品藥品檢驗(yàn)研究所提供，均已采用液相色譜法鑒定為正品。9份混合膽類藥材由標(biāo)準(zhǔn)品膽樣按比例混合而成。2×Taq PCR Master Mix、100 bp DNA Ladder、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T連接試劑盒、DH 5α感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京天根生物科技有限公司，三羥甲基氨基甲 烷［tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris］ 和乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）購自美國Genview公司，十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）購自美國Biosharp公司，無水乙醇（分析純）、NaAc結(jié)晶和異丙醇購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司，GelRed核酸染料購自美國Biotium公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest公司。HH-S精密恒溫水浴鍋購自江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠，NanoDrop One微量核酸蛋白測(cè)定儀購自美國Thermo公司，TC9600-G多功能梯度PCR儀購自美國Labnet公司，JY 300E通用型電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，UV WHITE-2020D紫外凝膠成像分析儀購自美國Biorad公司。

1.2 熊膽粉及其摻偽品豬膽粉和牛膽粉的DNA提取

取膽粉樣品0.1 g，置于1.5 mL Ep管中，加入P1（NaCl、EDTA、Tris、10%SDS、PK酶和dd H2O）溶液500μL，P2（10%SDS）溶液30μL，P3（PK酶）溶液15μL，56℃水浴1 h。加入P4（飽和NaAc）溶液500μL，10 000 g離心10 min。取上清加入等體積P5（異丙醇）溶液，－20℃靜置1 h。取出10 000 g離心5 min，棄去上清液。留沉淀加入P6溶液（70%冰凍乙醇溶液）500μL，11 000 g離心5 min，棄上清，并重復(fù)操作1次。沉淀室溫晾干，雙蒸水100μL溶解，作為供試品DNA溶液。采用微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)各方法所得微生物基因組DNA的濃度和純度，濃度為機(jī)器直接讀取數(shù)據(jù)；純度計(jì)算方法：波長為260和280 nm處吸光度（A）值的比值，即A（260）/A（280），每份基因組DNA原液重復(fù)測(cè)量3次。

1.3 物種特異性引物的設(shè)計(jì)

在GenBank數(shù)據(jù)庫中選取各動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素B基因：豬（AY830188.1）、牛（KU291093.1）和熊（EU573176.1），采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)物種特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。特異性引物序列見表1。

表1 特異性引物序列Tab.1 Sequences of specific primers

1.4 熊膽粉及其摻偽品豬膽粉和牛膽粉檢測(cè)

物種特異性PCR體系：反應(yīng)總體積為20μL，其中2×Taq PCR Master Mix 10μL，上游引物和下游引物（10 mg·L－1）各1.5μL，DNA模板（10 mg·L－1）1.5μL，無 菌ddH2O 5.5μL。PCR參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，循環(huán)35次，延伸72℃、10 min，4℃保存。

三重PCR體系：反應(yīng)總體積為20μL，其中2×Taq PCR Master Mix 10μL；不同物種上下游引物（10 mg·L－1）各0.5μL，共計(jì)3μL；每一物種DNA模板（10 mg·L－1）0.5μL，共計(jì)1.5μL；無菌ddH2O 5.5μL。PCR參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，循環(huán)35次，延伸72℃、10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)：5μL產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，電壓85 V、85 min。采用紫外凝膠成像儀觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.5 物種特異性基因片段克隆和測(cè)序比對(duì)

紫外凝膠成像儀下取不同物種特異性DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行凝膠回收，測(cè)定其DNA濃度。將目的基因與pGM-T載體連接為重組DNA，轉(zhuǎn)化至DH 5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂于LB培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。次日挑取白色陽性重組菌落置于LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒DNA，擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

質(zhì)粒DNA濃度測(cè)定：選取濃度超過100 mg·L－1的樣本，送至上海生物工程股份有限公司測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果與靶基因比對(duì)分析。序列結(jié)果經(jīng)NCBI-Nucleotide BLAST分析。

1.6 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.6.1 引物的特異性評(píng)價(jià) 將豬、牛和熊膽粉提取的DNA分別以豬、牛及熊進(jìn)行物種特異性引物擴(kuò)增，參照“1.4”中物種特異性PCR體系及條件擴(kuò)增，對(duì)引物的特異性進(jìn)行檢測(cè)。PCR過程中均以dd H2O作為空白對(duì)照。依據(jù)電泳結(jié)果評(píng)價(jià)引物的特異性。

1.6.2 多重PCR反應(yīng)體系的特異性評(píng)價(jià) 以1為遞減數(shù)量依次減少體系中模板DNA物種數(shù)，按“1.4”步驟中三重PCR體系及參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)多重PCR體系的特異性。PCR過程中均以ddH2O作為空白對(duì)照。依據(jù)電泳結(jié)果評(píng)價(jià)多重PCR體系的特異性。

1.6.3 多重PCR體系的靈敏度評(píng)價(jià) 將提取的熊膽粉、豬膽粉和牛膽粉DNA模板檢測(cè)濃度后稀釋至102mg·L－1，采用ddH2O 10倍梯度稀釋直至10－5mg·L－1，作 為PCR體 系DNA模 板。參照“1.4”步驟中三重PCR體系及參數(shù)，同時(shí)保持其中2種模板濃度始終不變，剩余物種模板濃度依次為102～10－5mg·L－1。依據(jù)電泳結(jié)果評(píng)價(jià)多重PCR體系的靈敏度。

1.6.4 混合膽樣檢測(cè)評(píng)價(jià)重復(fù)性 模擬摻假可能性，制備混合膽樣，每種模擬混合方式制備3份，共計(jì)27份樣品。參照“1.2”步驟中方法提取DNA，參照“1.4”步驟進(jìn)行電泳，電泳后采用紫外凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。隨機(jī)抽取其中5份混合膽樣DNA，對(duì)檢測(cè)體系進(jìn)行重復(fù)性評(píng)價(jià)。見表2。

表2 樣品模擬混合方式及其構(gòu)成比Tab.2 Simulation mixing modes of samples and their component ratios

2 結(jié) 果

2.1 熊膽粉及其摻偽品豬和牛膽粉DNA的提取

將膽粉樣DNA經(jīng)微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度和純度，重復(fù)3次。A（260）/A（280）處于1.70～2.00，質(zhì)量濃度均高于100 mg·L－1，該方法提取獲得的DNA樣品基本無蛋白質(zhì)污染且純度高，證明本研究建立的膽類藥材DNA提取方法可有效提取膽類藥材DNA。見表3。

表3 膽類藥材基因組DNA檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Genomic DNA test results of biliary herbs

2.2 克隆鑒定及其序列比對(duì)

克隆鑒定結(jié)果與預(yù)期目的條帶位置一致，瓊脂糖凝膠電泳圖譜分別于267、157和218 bp處出現(xiàn)單一特異性條帶。見圖1。

圖1 豬、牛和熊膽粉克隆質(zhì)粒的DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electropherogram of DNA PCR amplification products of suis fellis pulvis,pulvis billis bovis，and bear bile powder clone vectors

測(cè)序結(jié)果在NCBI-Nucleotide上采用相似性搜索算法（basic local alignment search tool，BLAST），與GenBank中已登記的豬（AY 830188.1）、牛（KU 291093.1）和熊（EU 573176.1）序列同源性達(dá)99%以上，證明多重PCR檢測(cè)體系特異性試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及PCR擴(kuò)增的特異性基因片段序列的正確性，同時(shí)也表明克隆的DNA片段分別為豬、牛和熊目的基因片段。見圖2。

圖2 豬（A）、牛（B）和熊（C）目的基因測(cè)序圖譜及序列比對(duì)分析Fig.2 Sequencing maps and sequence alignment analysis on target genes of pig(A),bovine(B),and bear(C)

2.3 特異性檢測(cè)

各物種引物特異性試驗(yàn)中分別僅于豬、牛和熊目的條帶處見單一特異條帶，其余泳道皆無條帶，表明本研究所設(shè)計(jì)引物特異性良好。1～7號(hào)泳道依次見：豬、牛、熊、豬/牛、豬/熊、牛/熊和豬/牛/熊特異性條帶。初步表明本研究所建立三重PCR引物之間互不干擾，體系特異性良好。見圖3。

圖3 引物特異性檢測(cè)電泳圖Fig.3 Electrophoregrams of specific test of primers

2.4 靈敏度檢測(cè)

豬膽粉、牛膽粉和熊膽粉最低檢測(cè)限均可達(dá)到1 mg·L－1，其他2種特異條帶亮度不受影響。表明本研究所建立多重PCR檢測(cè)體系結(jié)果穩(wěn)定，當(dāng)任意一種DNA減少至1 mg·L－1時(shí)，仍可準(zhǔn)確檢測(cè)，且無交叉干擾。見圖4。

圖4 多重PCR體系的靈敏度檢測(cè)電泳圖Fig.4 Electropherograms of sensitivity detection of multiplex PCR system

2.5 混合熊膽樣品檢測(cè)

模擬混合樣品經(jīng)DNA提取和多重PCR檢測(cè)體系擴(kuò)增后，未加入DNA模板的陰性對(duì)照泳道無條帶，其余各泳道條帶有無及明暗情況與各樣品原模擬混合方式大致相符。表明該多重PCR檢測(cè)體系特異性良好，3種特異性檢測(cè)成分的構(gòu)成比變化不影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性，可基本滿足熊膽粉中實(shí)際動(dòng)物源性摻偽情況檢測(cè)。見圖5。

圖5 混合熊膽樣品瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 Agargel electrophoregram of mixed bear bile samples

3 討 論

熊膽粉是傳統(tǒng)的名貴中藥材，被譽(yù)為四大動(dòng)物藥材之首，已有上千年藥用歷史［17］。膽粉類藥材形態(tài)相似，肉眼不易直觀分辨［18］，為確保熊膽粉產(chǎn)品的用藥功效，避免對(duì)患者帶來生命財(cái)產(chǎn)的嚴(yán)重?fù)p失，弘揚(yáng)中醫(yī)藥文化，有必要建立鑒別熊膽粉摻偽檢測(cè)的方法。

對(duì)于熊膽粉內(nèi)化學(xué)成分鑒定，王一博等［19］建立了對(duì)5種膽汁酸應(yīng)用高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定的檢測(cè)方法；石巖等［20］建立了測(cè)定熊膽粉主要膽汁酸類成分的HPLC-ELSD方法；李曉瓊等［21］采用一測(cè)多評(píng)法同步測(cè)定了熊膽粉中3種膽酸類成分含量，以熊去氧膽酸為內(nèi)參物，實(shí)現(xiàn)定量分析。上述方法彌補(bǔ)了檢測(cè)指標(biāo)單一、紫外基線漂移和靈敏度差等問題，可較為全面反映熊膽粉中膽汁酸成分含量。但熊膽粉的藥理作用機(jī)制尚未清楚，有關(guān)針對(duì)非膽汁酸類成分研究較少，其可能也在熊膽粉中發(fā)揮作用。已有研究［2］表明：可人工合成熊去氧膽酸，以其為指標(biāo)鑒別熊膽粉真?zhèn)我桩a(chǎn)生假陽性結(jié)果。

許亞春等［22］基于DNA條形碼技術(shù)對(duì)名貴中藥材熊膽粉及混偽品構(gòu)建鄰接樹，該方法雖具有很強(qiáng)物種特異性，但只能檢測(cè)出是否存在特定物種，只能對(duì)純正品或純偽品提供鑒定。本研究采用改良SDS-蛋白酶K裂解法（SDS proteinase K cleavage，SDS-PK）法提取含有膽汁酸類樣品DNA，其濃度高、純度好，為多重PCR檢測(cè)體系鑒別熊膽粉摻偽提供了良好的先決條件。基于多重PCR原理，根據(jù)豬、牛和熊線粒體細(xì)胞色素b基因設(shè)計(jì)出物種特異性引物，建立針對(duì)豬膽粉、牛膽粉和熊膽粉的多重PCR檢測(cè)體系，依據(jù)不同長度的擴(kuò)增片段進(jìn)行鑒定。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，最低檢測(cè)限可達(dá)到1 mg·L－1，且模擬實(shí)際摻假情況下，DNA含量低至檢測(cè)樣品總DNA含量10%時(shí)，仍可準(zhǔn)確檢測(cè)。與其他檢測(cè)技術(shù)比較，其對(duì)混合品鑒別時(shí)具有高效性的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)熊膽粉偽品一次檢測(cè)，即同時(shí)檢出多種動(dòng)物源性成分摻假，大大縮短了檢測(cè)周期。

田娜等［23］基于STR分型原理建立用于膽粉類藥材及其摻雜樣品的通用DNA指紋圖譜鑒別方法，但該法分型結(jié)果對(duì)儀器分辨率、片段大小準(zhǔn)確性和操作人員等要求高，使其應(yīng)用受到限制。本研究采用的檢測(cè)方法無需昂貴的檢測(cè)儀器，經(jīng)濟(jì)便捷，具有應(yīng)用價(jià)值，適用于膽類藥材市場(chǎng)質(zhì)控監(jiān)測(cè)。為方便后續(xù)商品化試劑盒組裝應(yīng)用，本課題組將豬、牛和熊物種特異性條帶克隆作為陽性對(duì)照，解決實(shí)際應(yīng)用中標(biāo)準(zhǔn)品難以獲取的問題。后續(xù)可將本研究成果通過熒光定量PCR技術(shù)，建立多重?zé)晒舛繖z測(cè)體系，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品中膽類藥材DNA含量的精確檢測(cè)。