吳壯志,賀小寧,陳思祺

（海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院口腔科，海南 海口 570100）

口腔鱗狀細胞癌 （oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常見的口腔惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢［1］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小的非編碼RNA，在轉錄后水平調(diào)控靶基因的表達［2］。研究［3-5］顯示：miRNA表達失調(diào)與OSCC細胞生物學行為及其惡性進展有關。微小RNA-124-3p（microRNA-124-3p，miR-124-3p）在乳腺癌和膀胱癌組織中低表達，過表達miR-124-3p能抑制癌細胞增殖和侵襲［6-7］。而miR-124-3p在OSCC中的作用尚未見報道。腦源性神經(jīng)生長因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在宮頸癌和OSCC等多種腫瘤組織中高表達［8-9］。靶基因預測結果顯示：BDNF與miR-124-3p存在結合位點，但miR-124-3p是否靶向BDNF調(diào)控OSCC進展尚未清楚。本研究探討miR-124-3p對OSCC HSC2和KON細胞增殖和侵襲的影響及其與BDNF之間的靶向關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2017年3月—2018年6月本科進行手術切除的OSCC患者的癌組織標本39例和正常口腔黏膜組織標本39例，置于－80℃保存。本研究經(jīng)本醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準號為LW2020015），所有患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 動物、主要試劑和儀器SPF級BALB/c雄性裸鼠10只，體質量18～20 g，購自湖南省斯萊克實驗生物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。按照實驗動物管理和倫理委員會制度對裸鼠進行飼養(yǎng)和相關實驗。OSCC、HSC2和KON細胞及人永生化口腔上皮細胞HIOEC細胞（美國Scien Cell公司），引物（上海生工公司），Defined Keratinocyte培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8試劑盒和胰蛋白酶（美國Gibco公司），Western blotting檢測相關試劑（廣州碧云天公司），BDNF單克隆抗體及IgG二抗（美國CST公司），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega公司），Transwell小室（美國Coming公司），miR-124-5p inhibitor、inhibitor-NC和siBDNF均由上海吉瑪公司合成。ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)口腔上皮HIOEC細胞，含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)OSCCHSC2細胞，口腔底部癌KON細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測組織和細胞中miR-124-3p和BDNF mRNA表達水平TRIzol法提取OSCC和正?？谇唤M織樣本或對數(shù)生長期的細胞樣本總RNA，合成模板鏈cDNA。RT-qPCR的反應條件：95℃預變性30 min，95℃變性12 s，60℃退火、延伸12 s，共40個循環(huán)。反應結束后分析Ct值，采用2－△△Ct法計算細胞中miR-124-3p和BDNF mRNA表達水平，并采用生存分析曲線分析miR-124-3p表達與患者生存率的關系。

1.5 裸鼠成瘤實驗檢測各組裸鼠體內(nèi)腫瘤的質量將裸鼠分為miR-NC組和miR-124-3p組，每組5只。取0.2 mL密度為1×106mL－1的癌細胞，裸鼠右前肢接種腫瘤，SPF環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)。接種后每隔10 d，固定時間測量腫瘤的最長直徑a（mm）和最短直徑b（mm），計算腫瘤體積（mm3），腫瘤體積V=a×b2×0.52，同時繪制移植瘤的生長曲線圖。約第60天，裸鼠皮下形成較大腫瘤，斷頸法處死裸鼠，取出皮下腫瘤組織，稱瘤體質量。

1.6 Western blotting法檢測細胞中BDNF蛋白表達水平RIPA蛋白裂解液細胞提取總蛋白，采用BCA法測定樣品蛋白的濃度。取60μg變性處理的目的蛋白和蛋白Marker進行SDS-PAGE蛋白電泳。然后轉至PVDF膜，隨后封閉1 h，4℃條件下，將封閉后的PVDF膜置入1∶1 000倍稀釋的一抗中反應過夜，37℃下將PVDF膜轉入1∶2 000倍稀釋的二抗中反應2 h。顯色并采集圖像，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.7 細胞轉染和分組收集對數(shù)生長期的HIOEC、HSC2和KON細胞，以105個/孔的密度接種于6孔板，細胞融合度約為60%時，根據(jù)預實驗結果，按照慢病毒轉染說明書步驟操作，將miR-124-3p、miR-NC、inhibitor-NC、miR-124-3p inhibitor、siBDNF、BDNF和miR-124-3p+BDNF分別轉染至HSC2及KON細胞，作為miR-124-3p組、miR-NC組、inhibitor-NC組、miR-124-3p inhibitor組、siBDNF組、BDNF組及miR-124-3p+BDNF組。制備穩(wěn)定轉染miR-124-3p和BDNF的細胞株，收集各組細胞。

1.8 CCK-8法檢測各組細胞存活率按上述方法轉染細胞，取對數(shù)生長期的各組HSC2和KON細胞，以100μL/孔的密度接種至96孔板，每組設6個重復，分別轉染48、72和96 h時加入CCK-8溶液20μL，采用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度（A）值，以A值代表細胞存活率。

1.9 Transwell實驗檢測各組細胞侵襲率先將穩(wěn)定轉染的各組細胞以106個/孔的密度接種于細胞6孔板，細胞融合度達到70%，無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為105mL－1，取100μL加入上室中，取600μL含血清培養(yǎng)基加入下室中，細胞常規(guī)培養(yǎng)過夜。取出小室，擦去上室內(nèi)細胞，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細胞數(shù)，隨機取5個視野拍照計數(shù)，取平均數(shù)即為侵襲細胞數(shù)，計算細胞侵襲率。細胞侵襲率=侵襲細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.10 雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-124-3p與BDNF的靶向關系采用在線軟件Target Scan（http：//www.targetscan.org/）預測miR-124-3p與BDNF3′UTR存在的結合位點，采用LipofectamineTM2000 將 BDNF 3′UTR-WT 和BDNF 3′UTR-MUT熒光素酶報告載體分別與miR-124-3p、miR-NC、inhibitor-NC和miR-124-3p inhibitor共轉染HSC2和KON細胞，24 h后收獲細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊操作，計算細胞熒光素酶活性。細胞熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.11 RNA免疫沉淀實驗檢測miR-124-3p與BDNF的靶向關系按照Magna RIP RNA-Binding Protein試劑盒說明書要求進行RIP實驗。具體操作見使用說明書。

1.12 統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。miR-124-3p表達水平、細胞存活率、細胞侵襲率、細胞中miR-124-3p和BDNF mRNA表達水平及BDNF蛋白表達水平、腫瘤體積和質量均滿足正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 OSCC組織和HSC2及KON細胞中miR-124-3p表達水平以及患者生存率OSCC組織中miR-124-3p表達水平低于正?？谇火つそM織（P＜0.05），HSC2和KON細胞中miR-124-3p表達水平明顯低于HIOEC細胞（P＜0.05）。低表達miR-124-3p患者生存率明顯低于高表達miR-124-3p患者（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各種組織和細胞中miR-124-3p表達水平及2組患者生存率Fig.1 Expression levels of miR-124-3p in different kinds of tissues and cells and survival rate of patients in two groups

2.2 2組細胞中miR-124-3p表達水平、HSC2和KON細胞存活率及細胞侵襲率miR-124-3p組HSC2和KON細胞中miR-124-3p表達水平高于miR-NC組（P＜0.05），見圖2。48、72和96 h時，miR-124-3p組HSC2及KON細胞存活率均明顯低于miR-NC組（P＜0.05），見圖3和4。miR-124-3p組HSC2和KON細胞的細胞侵襲率較miR-NC組均明顯降低（P＜0.05）。見圖5和6。

圖2 miR-124-3p組和miR-NC組細胞中miR-124-3p的表達水平Fig.2 Expression levels of MiR-124-3p in cells in miR-124-3p group and miR-NC group

圖3 miR-124-3p組和miR-NC組HSC2細胞存活率Fig.3 Survival rates of HSC2 cells in miR-124-3p group and miR-NC group

圖5 2組HSC2和KON細胞侵襲形態(tài)(結晶紫，×200)Fig.5 Invasion morphology of HSC2 and KON cells in two groups(Crystal violet,×200)

2.3 各組裸鼠腫瘤質量、體積和腫瘤組織中BDNF蛋白表達水平裸鼠成瘤實驗中接種部位10 d后均長出腫瘤，成瘤率為100%，miR-124-3p組裸鼠腫瘤質量（0.43 g±0.05 g）較miR-NC組（0.74 g±0.06 g）明顯降低，且腫瘤體積在第40、50和60天時較miR-NC組明顯縮小（P＜0.05）。miR-124-3p組裸鼠腫瘤組織中BDNF蛋白表達水平（1.00±0.07）明顯低于miR-NC組（0.46±0.06）（P＜0.05）。見圖7和8。

圖4 miR-124-3p組和miR-NC組KON細胞存活率Fig.4 Survival rates of KON cells in miR-124-3p group and miR-NC group

圖6 2組HSC2和KON細胞的細胞侵襲率Fig.6 Invasion rates of HSC2 and KON cells in two groups

圖7 2組裸鼠移植瘤形態(tài)表現(xiàn)Fig.7 Morphology of transplanted tumor of nude mice in two groups

圖8 不同時間2組裸鼠移植瘤體積Fig.8 Volumes of transplanted tumor of nude mice in two groups at different time points

2.4 miR-124-3p與BDNF的靶向關系及HSC2和KON細胞中熒光素酶活性miRcode數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)：miR-124-3p與BDNF 3′UTR存在結合位點，見圖9。過表達miR-124-3p后轉染BDNF 3′UTRWT的HSC2和KON細胞中雙熒光素酶活性均明顯低于轉染BDNF 3′UTR-WT的HSC2和KON細胞，抑制miR-124-3p后轉染BDNF 3′UTR-MUT的HSC2和KON細胞中雙熒光素酶活性均明顯高于轉染BDNF 3′UTR-MUT的HSC2和KON細胞，見圖10；HSC2和KON細胞中miR-124-3p組BDNF的富集率均明顯高于miR-NC組（P＜0.05），見圖11。Spearman相關分析發(fā)現(xiàn)：BDNF表達水平與miR-124-3p表達水平呈負相關關系（r2=－0.561，P＜0.01）。見圖12。

圖9 互補序列Fig.9 Complementary sequences

圖10 各組HSC2和KON細胞中熒光素酶活性Fig.10 Luciferase activities in HSC2 and KON cells in various groups

圖11 RNA免疫沉淀檢測結果Fig.11 RNA immunoprecipitiotation detection results

圖12 OSCC組織中miR-124-3p與BDNF表達水平相關性Fig.12 Correlation between expression levels of miR-124-3p and BDNF in OSCC tissue

2.5 各組HSC2和KON細胞中BDNF mRNA和蛋白表達水平、細胞存活率及細胞侵襲率OSCC組織中BDNF mRNA表達水平（2.01±0.08）高于正?？谇唤M織（1.00±0.04）（P＜0.05）。siBDNF組HSC2和KON細胞中BDNF mRNA表達水平均明顯 低 于inhibitor-NC組（P＜0.05），BDNF組HSC2和KON細胞中BDNF mRNA表達水平均明顯 高 于inhibitor-NC組（P＜0.05）；BDNF組HSC2和KON細胞中BDNF蛋白表達水平明顯高于inhibitor-NC組（P＜0.05），siBDNF組HSC2和KON細胞中BDNF蛋白表達水平明顯低于inhibitor-NC組（P＜0.05）。作用48、72和96 h時，siBDNF組細胞存活率均明顯低于inhibitor-NC組（P＜0.05），BDNF組細胞存活率均明顯高于inhibitor-NC組（P＜0.05）。BDNF組細胞侵襲率明顯高于inhibitor-NC組（P＜0.05），siBDNF組細胞侵襲率明顯低于inhibitor-NC組（P＜0.05）。見圖13～16。

圖13 各組HSC2和KON細胞中BDNF mRNA表達水平Fig.13 Expression levels of BDNF mRNA in HSC2 and KON cells in various groups

2.6 miR-124-3p作用后各組HSC2和KON細胞中BDNF蛋白表達水平、細胞存活率及細胞侵襲率miR-124-3p組HSC2和KON細胞中BDNF蛋白表達水平明顯低于miR-NC組（P＜0.05），miR-124-3p+BDNF組HSC2和KON細胞中BDNF蛋白表達水平明顯高于miR-124-3p組（P＜0.05）。作用48、72和96 h時，miR-124-3p+BDNF組HSC2和KON細胞存活率均明顯高于miR-124-3p組（P＜0.05）。miR-124-3p+BDNF組細胞侵襲率明顯高于miR-124-3p組（P＜0.05）。見圖17～19。

圖17 miR-124-3p作用后各組HSC2和KON細胞中BDNF蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.17 Electrophoregram（A）and histogram（B）of expressions of BDNF protein in HSC2 and KON cells in various groups after treated with miR-124-3p

3 討 論

鱗狀細胞癌是指癌細胞以鱗狀細胞為主，根據(jù)顯微鏡下的表現(xiàn)結果診斷為鱗狀細胞癌，鱗狀細胞癌多見于頭頸部腫瘤和肺部腫瘤。OSCC是指發(fā)生于口腔內(nèi)，以鱗狀細胞為主的惡性腫瘤，癌細胞可以發(fā)生于牙齦、硬腭、舌體、頰黏膜和嘴唇等多種器官，屬于頭頸部惡性程度最高、危害性最大的腫瘤，約占頭頸部鱗狀細胞癌的50%。根據(jù)組織來源的不同可以分為頰癌和舌癌等，其中舌癌在臨床上最為常見，約占50%，其活動度比較好，血運豐富，淋巴轉運率也比較高，預后效果較差。OSCC容易出現(xiàn)遠處轉移，如肺轉移、骨轉移、淋巴道轉移和血運轉移等；另外其可以造成口腔功能的損失，如長在舌頭會影響語言和吞咽功能，當進一步發(fā)展，還可引起遠處轉移，導致局部潰爛，影響患者的生活質量，危害患者的生命。局部活檢和術后病理診斷可以確診OSCC，同時根據(jù)腫瘤的分化程度和病理類型，可以選擇合適的治療方式來控制腫瘤，明確病理類型。

圖14 各組HSC2和KON細胞中BDNF蛋白表達電泳圖（A)和直條圖（B)Fig.14 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of BDNF protein in HSC2 and KON cells in various groups

圖15 不同時間點各組HSC2(A)和KON(B)細胞存活率Fig.15 Survival rates of HSC2(A)and KON(B)cells in various groups at different time points

圖16 各組HSC2和KON細胞的侵襲細胞率Fig.16 Invasion rates of HSC2 and KON cells in various groups

OSCC是世界公認的衛(wèi)生難題，在世界范圍內(nèi)其 發(fā) 病 率 逐 年 升 高［9］。近 幾 年 研 究［10］顯 示：miRNA在腫瘤的形成、生長和轉移中均發(fā)揮重要作用，還可作為腫瘤的標志物。研究［11］顯示：miR-124-3p低表達參與誘導胃癌細胞的侵襲和上皮間質轉化，促進胃癌發(fā)生。沉默circ_0026123通過上調(diào)miR-124-3p表達來抑制卵巢癌進展［12］。miR-124-3p可通過靶向STAT 3抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲［13］。此外，miR-124-3p表達上調(diào)對星形膠質瘤的增殖侵襲和有氧酵解均有抑制作用［14］。本研究結果顯示：miR-124-3p在OSCC組織和細胞中呈低表達，提示miR-124-3p參與調(diào)控OSCC細胞惡性行為，過表達miR-124-3p可以抑制HSC2和KON細胞增殖及侵襲能力，既往研究［15-16］顯示miR-124-3p在胃癌和肝癌中的抑癌作用相似，此外，過表達miR-124-3p對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長具有抑制作用。本課題組進一步研究過表達miR-124-3p對細胞和裸鼠成瘤的影響發(fā)現(xiàn)：過表達miR-124-3p可以抑制HSC2和KON細胞的增殖及侵襲，抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長。

圖18 miR-124-3p作用后不同時間點各組HSC2(A)和KON(B)細胞存活率Fig.18 Survival rates of HSC2(A)and KON(B)cells in various groups at different time points

圖19 miR-124-3p作用后各組HSC2和KON細胞的細胞侵襲率Fig.19 Invasion rates of HSC2 and KON cells in various groups after treated with miR-124-3p

BDNF首次是從豬腦中分離純化出的具有促進神經(jīng)生長活性的一種蛋白，可起到調(diào)節(jié)痛苦和恐懼感覺的作用［17］。BDNF能促進運動神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元等神經(jīng)元的存活，刺激神經(jīng)細胞突起的生長和長芽，誘導合成神經(jīng)元表型的蛋白質，增加神經(jīng)遞質的合成，改變細胞膜上離子通道活性。有研究［18-20］顯示：BDNF在胰腺導管癌和膀胱癌組織中表達增加。BDNF表達上調(diào)促進宮頸癌細胞增殖［8］，并誘導卵巢癌 細胞遷移及侵襲［21］。miR-15a-5p通過靶向BDNF抑制人肝癌細胞［22］。本研究結果顯示：過表達miR-124-3p后移植瘤組織中BDNF表達水平低于過表達miR-124-3p前，抑制BDNF表達導致HSC2和KON細胞的增殖侵襲能力降低，這與過表達miR-124-3p的抗癌作用吻合，而上調(diào)BDNF則促進HSC2和KON細胞增殖進而提高細胞侵襲力。雙熒光素酶結合實驗和RIP實驗證實：BDNF是miR-124-3p的靶基因，同時BDNF可逆轉miR-124-3p抑制HSC2和KON細胞的增殖及侵襲的作用，表明miR-124-3p可通過調(diào)控BDNF在OSCC組織中發(fā)揮抑癌作用，為miR-124-3p作為OSCC治療靶點提供理論依據(jù)和實驗基礎。綜上所述，miR-124-3p能夠抑制促癌因子BDNF表達，抑制OSCC細胞增殖、侵襲和腫瘤生長。本研究結果不僅闡明了miR-124-3p對OSCC的功能及其作用機制，也為OSCC的治療提供了新的靶點。