仲春雪,徐 華,張 晨,何麗娟,4

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院教學(xué)科研辦公室和中心實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖助孕中心，新疆 烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院社會(huì)醫(yī)學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830054；4.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院博士后流動(dòng)站，新疆 烏魯木齊 830054）

煙草中含有多種有害成分，現(xiàn)有研究［1-2］表明：13%的男性不育癥歸因于吸煙，而育齡男性（20～39歲）中吸煙者占46%。這也引起了對(duì)于吸煙所致男性生殖毒性的關(guān)注。精子發(fā)生是處于睪丸曲細(xì)精管中的精原細(xì)胞增殖、分化形成成熟精子的過(guò)程［3］。長(zhǎng)期大量吸煙可產(chǎn)生睪丸毒性，使睪丸正常的精子發(fā)生過(guò)程受到干擾，造成精液質(zhì)量降低和精子受精能力下降而影響男性生育力［4］。精子發(fā)生過(guò)程離不開(kāi)支持細(xì)胞，支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性為精母細(xì)胞順利減數(shù)分裂形成精子提供了必要保障。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）參與生物體細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)過(guò)程［5］，并作為重要的表觀遺傳因子在雄性生物睪丸的正常發(fā)育和精子發(fā)生過(guò)程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用［6-7］。然而與吸煙所致睪丸毒性損傷有關(guān)的微小RNA（microRNA，miRNA）及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因此本課題組前期采用miRNA高通量芯片測(cè)序技術(shù)篩選出了5條在香煙煙霧暴露后睪丸組織差異性表達(dá)的miRNA，選擇表達(dá)下調(diào)的微小RNA 138-5p（microRNA 138-5p，miR-138-5p）進(jìn)行后續(xù)研究；對(duì)差異性miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能分析后發(fā)現(xiàn)：其靶基因參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程。雖然以往有研究［8］顯示：miR-138-5p參與腫瘤細(xì)胞的調(diào)控過(guò)程，然而關(guān)于miR-138-5p在吸煙所致睪丸細(xì)胞損傷中的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證香煙煙霧暴露對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞的損傷作用，并分析miRNA-138-5p在其中發(fā)揮的重要調(diào)控作用，尋找吸煙所致雄性生物生殖損傷的生物標(biāo)志物，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器200只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2015-0004，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（新）2015-000，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度為20℃～25℃、相對(duì)濕度為40%～70%。大鼠抑制素B酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物公司，波形蛋白一抗購(gòu)自武漢Bioworld公司，AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒購(gòu)自上海貝博生物公司，TUNEL染色試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（型號(hào)C1086）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，Bulge-Loop?miRNA試劑盒、miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miScript SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qigen公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)檢測(cè)儀、流式細(xì)胞儀（BD-FACSVerse）和Real-time檢測(cè)儀（ABI-7500）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 動(dòng)物分組和香煙煙霧的干預(yù)方法依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為2、4、6、8和12周香煙暴露組，其中每個(gè)時(shí)間香煙暴露組中又分為對(duì)照組和低、中、高劑量香煙暴露組（分別給予每只大鼠每天10、20和30支香煙），共計(jì)20組，隨后將雄鼠隨機(jī)分至各組，每組10只。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（審批證號(hào)：IACUC-20151105011）。受試物選擇某卷煙廠生產(chǎn)的過(guò)濾嘴香煙（CO含量為12 mg/支，焦油量為11 mg/支，煙堿量為1.0 mg/支）。本研究預(yù)先準(zhǔn)備80 cm×60 cm×80 cm的靜式染毒箱，將低劑量香煙暴露組大鼠置入箱中，密閉狀態(tài)下將10支香煙濾嘴依次插入下側(cè)的進(jìn)氣道并點(diǎn)燃，待香煙充分燃盡后取出大鼠。中劑量香煙暴露組按以上方法燃盡10支香煙后開(kāi)箱通風(fēng)10 min，繼續(xù)點(diǎn)燃10支香煙直至燃盡。高劑量香煙暴露組大鼠染毒方法以此類推。對(duì)照組雄鼠置于同樣的染毒箱中，但不進(jìn)行任何處理。染毒過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)染毒箱內(nèi)的總懸浮顆粒物和CO濃度。連續(xù)每日染毒，2、4、6、8和12周時(shí)分別麻醉處死各組大鼠，摘取雙側(cè)睪丸。一側(cè)大鼠睪丸組織置入-80℃凍存?zhèn)溆茫硪粋?cè)睪丸組織置入4%多聚甲醛中固定后備用。

1.3 各組大鼠血漿中抑制素B水平檢測(cè)在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣品孔分別加入100μL工作液，37℃孵育60 min后洗板3次并甩干；各孔加入100μL酶結(jié)合物工作液，孵育30 min后洗板5次；加入90μL底物溶液，37℃避光孵育15 min；最后加入50μL終止液，于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（A）值，將樣品的A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式，計(jì)算大鼠血漿中抑制素B水平。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測(cè)各組大鼠睪丸組織中miR-138-5p表達(dá)水平采用Bulge-Loop?miRNA試劑盒、miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miScript SYBR?Green PCR試劑盒分別提取睪丸組織的miRNA、并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量分析。miR-138-5p正 向引 物：5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAG-3′，miR-138-5p反 向 引 物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；內(nèi) 參U 6正 向 引 物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U 6反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采 用2－△△Ct法計(jì)算miR-138-5p表達(dá)水平。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠睪丸支持細(xì)胞中波形蛋白表達(dá)水平對(duì)各組大鼠睪丸組織切片行烤片、梯度脫蠟、去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶及抗原修復(fù)處理后，加入波形蛋白一抗（1∶200），繼續(xù)滴加二抗，37℃孵育20 min后加DAB顯色，將切片依次放入蘇木素復(fù)染7 min，鹽酸乙醇分化5 s，PBS洗片5 min；再經(jīng)梯度脫水后封片，在光鏡下觀察大鼠睪丸組織中波形蛋白表達(dá)情況，采用Cells Sens生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算免疫組織化學(xué)法檢測(cè)的波形蛋白表達(dá)水平。

1.6 香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）的制備將燃燒的香煙經(jīng)負(fù)壓吸引器連續(xù)抽吸至磷酸鹽緩沖液中形成懸液（3支·mL－1），3 min燃盡，懸液采用1 mmol·L－1NaOH調(diào)節(jié)p H值為7.0，經(jīng)0.22μm微孔過(guò)濾膜除菌過(guò)濾形成CSE原液。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)和CSE干預(yù)小鼠睪丸TM 4支持細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type CultureCollection，CCTCC），加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至70%～80%，采用PBS液洗滌2次。將制備好的CSE原液采用培養(yǎng)基稀釋至5%（5%CSE組）和10%（10%CSE組），并設(shè)對(duì)照組（0%CSE組），進(jìn)行分組干預(yù)，24 h后進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.8 MTT法檢測(cè)各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞存活率CSE干預(yù)后，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后接種于96孔板，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入10μL MTT，培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。加入200μL DMSO后震蕩10 min。于492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定同一時(shí)間點(diǎn)A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A值）/（對(duì)照組A值－空白組A值）×100%。

1.9 各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測(cè)將TM 4細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。將100μL上清液轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板上。加入細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒LDH溶液100μL，37℃避光孵育15 min。加入50μL終止液（1 nmol·L－1HCL）停止反應(yīng)，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔A值，以A值代表各組細(xì)胞中LDH活性。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率CSE干預(yù)細(xì)胞后采用胰酶消化，1 500 r·min－1離心5 min；加入300μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞；分別加入5μL AnnexinⅤ-FITC和10μL PI染料，37℃避光孵育15 min；采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，采用CELL Quest軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.11 睪丸TM 4細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-138-5p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒采用限制性內(nèi)切酶酶切目的基因和載體，按照試劑盒說(shuō)明對(duì)其進(jìn)行切膠純化，并將目的片段與載體連接。采用100μL無(wú)血清培養(yǎng)基分別稀釋pcDNA 3.1-EGFP-miR-138-5p質(zhì)粒和 7.5 μL Lipofectamine 2 000；將2種液體混合，室溫孵育20 min；在培養(yǎng)板中加入200μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6 h；吸除上清液后加入3 mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.12 TUNEL法檢測(cè)各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞凋亡率在睪丸TM 4細(xì)胞過(guò)表達(dá)miRNA-138-5p后，采用相同方法將其暴露于CSE中，分為對(duì)照組、5%CSE組、5%CSE+Pri-miRNA-138-5p Ctrl組、5%CSE+Pri-miRNA-138-5p組、10%CSE組、10%CSE+Pri-miRNA-138-5p Ctrl組和10%CSE+Pri-miRNA-138-5p組，采用TUNEL法和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒并通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)各組睪丸TM 4細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.13 熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞凋亡形態(tài)各組細(xì)胞切片經(jīng)多聚甲醛固定后，加入含0.3%Triton X-100的PBS，37℃孵育5 min；繼續(xù)在0.3%H2O2溶液中孵育20 min；加入生物素標(biāo)記液，洗滌后加入50μL TUNEL反應(yīng)液，37℃避光孵育1 h；PBS洗滌3次后封片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠血漿中抑制素B水平，睪丸組織中miR-138-5p表達(dá)水平，睪丸支持細(xì)胞中睪丸波形蛋白表達(dá)水平，各組睪丸TM 4細(xì)胞存活率、細(xì)胞中LDH活性和細(xì)胞凋亡率均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血漿中抑制素B水平與對(duì)照組比較，暴露初期（2、4和6周時(shí)）各劑量香煙暴露組大鼠血漿中抑制素B水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第8周時(shí)，高劑量暴露組和第12周時(shí)各劑量組大鼠血漿中抑制素B水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。大鼠血漿中抑制素B水平在長(zhǎng)期香煙煙霧暴露后明顯降低，且呈現(xiàn)出一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血漿中抑制素B水平T ab.1 Levels of inhibin B in plasma of rats in various groups (n=10,±s)

表1 各組大鼠血漿中抑制素B水平T ab.1 Levels of inhibin B in plasma of rats in various groups (n=10,±s)

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group 4 6 8 Control Cigarette exposure Low dose Middle dose High dose Level of inhibin B(weak) 2 25.64±1.06 24.67±1.23 25.12±0.98 24.45±1.12 12 25.64±1.06 20.19±1.99*20.34±1.43*19.14±1.02**27.05±2.26 25.69±1.82 23.37±2.99 27.43±1.69 24.34±1.70 21.82±1.27 24.85±1.14 23.87±0.76 22.80±1.32 23.63±1.58 19.30±0.77 19.88±0.94*

2.2 各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞中睪丸波形蛋白表達(dá)水平對(duì)各組大鼠睪丸組織切片行免疫組織化學(xué)分析，在光鏡下可見(jiàn)：對(duì)照組大鼠睪丸細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)陽(yáng)性黃染，說(shuō)明波形蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，而香煙暴露組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞中睪丸組織波形蛋白表達(dá)水平逐漸降低，見(jiàn)圖1。對(duì)圖像進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，暴露2、4、6、8和12周時(shí)，高劑量香煙暴露組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞中睪丸波形蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞中睪丸波形蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of vimentin in testicular TM 4 cells of rats in various groups (n=10,±s)

表2 各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞中睪丸波形蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of vimentin in testicular TM 4 cells of rats in various groups (n=10,±s)

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group 4 6 8 Control Cigarette exposure Low dose Middle dose High dose Expression level of vimentin in testicular TM 4 cells(weak)2 27.90±6.27 27.13±3.76 26.12±6.12 28.12±4.93 12 25.12±6.12 18.89±2.54 12.76±2.85**10.48±1.28**34.56±6.65 19.62±3.01*15.02±7.00*23.19±9.70 14.14±6.89*13.90±5.48*28.19±1.32 14.46±8.23*10.88±5.55**21.50±5.23 20.42±4.68*10.64±3.24**

圖1 各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞中睪丸波形蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×400）Fig.1 Expressions of vimentin in testicular TM 4 cells of rats in various groups(Immunohistochemistry,×400)

2.3 各組大鼠睪丸組織中miR-138-5p表達(dá)水平與對(duì)照組比較，香煙煙霧暴露組大鼠睪丸組織中miR-138-5p表達(dá)水平逐漸降低，且呈現(xiàn)一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組比較，暴露初期（第2、4和6周時(shí)）各組大鼠睪丸組織中miR-138-5p表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第8周時(shí)，中和高劑量香煙暴露組及第12周時(shí)各劑量香煙暴露組大鼠睪丸組織中miR-138-5p表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠睪丸組織中miR-138-5p表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of miR-138-5p in testicular tissue of rats in various groups (n=5,±s)

表3 各組大鼠睪丸組織中miR-138-5p表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of miR-138-5p in testicular tissue of rats in various groups (n=5,±s)

*P＜0.05 compared with control group.

Group 4 6 8 Control Cigarette exposure Low dose Middle dose High dose Expression level of miR-138-5p(weak)2 1.02±0.21 1.01±0.33 1.01±0.12 1.01±0.17 12 1.01±0.17 0.63±0.12*0.53±0.14*0.48±0.14*1.12±0.23 0.98±0.10 0.89±0.37 0.97±0.19 1.09±0.20 0.88±0.33 0.94±0.19 0.79±0.10 0.80±0.12 0.70±0.23 0.81±0.07*0.67±0.20*

2.4 各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞存活率和睪丸TM 4細(xì)胞中LDH活性與對(duì)照組比較，5%CSE組和10%CSE組TM 4細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與對(duì)照組比較，5%CSE組和10%CSE組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞中LDH活性降低（P＜0.05或P＜0.01），且隨著CSE濃度的增加，LDH活性逐漸降低。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞存活率和睪丸TM 4細(xì)胞中LDH活性Tab.4 Survival rates of testicular T M 4 cells and LDH activities in testicular TM 4 cells of rats in various groups(n=3,±s)

表4 各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞存活率和睪丸TM 4細(xì)胞中LDH活性Tab.4 Survival rates of testicular T M 4 cells and LDH activities in testicular TM 4 cells of rats in various groups(n=3,±s)

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control 5%CSE 10%CSE LDH activity[λB/(U·L－1)]187.27±10.62 244.19±19.11*573.78±17.02**Survival rate of TM 4 cells(η/%)100.00±0.00 79.18±1.92*68.34±4.09**

2.5 各組睪丸TM 4細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)睪丸細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞基本無(wú)凋亡，5%CSE組TM 4細(xì)胞細(xì)胞凋亡率增加至（18.82±0.44）%，10%CSE組TM 4細(xì)胞凋亡率增加 至（31.33±0.66）%；與 對(duì) 照 組（3.51%±0.34%）比較，5%CSE組和10%CSE組細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)香煙煙霧暴露后各組睪丸TM 4細(xì)胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of testicular TM 4 cells of rats in various groups after cigarette smoking exposure detected by flow cytometry

2.6 過(guò)表達(dá)miR-138-5p后各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞增殖率與對(duì)照組比較，5%CSE組、5%CSE+Pri-miRNA-138-5p Ctrl組、5%CSE+Pri-miRNA-138-5p組、10%CSE組、10%CSE+Pri-miRNA-138-5p Ctrl組和10%CSE+Pri-miRNA-138-5p組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05或P＜0.01）；與5%CSE組比較，5%CSE+Pri-miRNA-138-5p組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05或P＜0.01）；與10%CSE組比較，10%CSE+PrimiRNA-138-5p組大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表5。

表5 過(guò)表達(dá)miR-138-5p后各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞增殖率Tab.5 Proliferation rates of testicular TM 4 cells of rats in various groups after over-expression of miR-138-5p (n=3,x±s,η/%)

2.7 過(guò)表達(dá)miR-138-5p后各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞凋亡形態(tài)和細(xì)胞凋亡率熒光顯微鏡下，各組TM 4細(xì)胞均有凋亡表現(xiàn)。與對(duì)照組比較，5%CSE組和10%CSE組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05或P＜0.01）。與5%CSE組 比 較，5%CSE+Pri-miRNA-138-5p組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。與10%CSE組比較，10%CSE+Pri-miRNA-138-5p組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3和4。

圖3 熒光顯微鏡觀察TUNEL染色后各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞凋亡形態(tài)表現(xiàn)(×400)Fig.3 Apoptotic morphology of testicular TM 4 cells of rats in various groups after TUNEL staining observed by fluorescence microscope(×400)

3 討 論

睪丸支持細(xì)胞也被稱為“保姆細(xì)胞”，位于生精上皮，是形成睪丸組織結(jié)構(gòu)的重要體細(xì)胞［9］。支持細(xì)胞為各級(jí)生精細(xì)胞提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)保障，同時(shí)可阻止多種有害物質(zhì)進(jìn)入生精小管［10］。相鄰支持細(xì)胞間通過(guò)緊密連接便形成了血睪屏障（bloodtestis barrier，BTB），血睪屏障作為哺乳動(dòng)物的天然屏障，在精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［11］。支持細(xì)胞受到破壞后，血睪屏障的完整性即發(fā)生改變，而完整的血睪屏障為正常精子發(fā)生過(guò)程提供了重要的微環(huán)境，以保證前細(xì)線期精母細(xì)胞能夠順利進(jìn)入生精小管從而分化為成熟精子［12］。由此可見(jiàn)，精子發(fā)生過(guò)程離不開(kāi)支持細(xì)胞，支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性為血睪屏障發(fā)揮其正常功能提供了必要保障，同時(shí)也確保精母細(xì)胞能夠順利減數(shù)分裂形成成熟精子，本研究所用TM 4細(xì)胞即為睪丸支持細(xì)胞。

高表達(dá)于支持細(xì)胞的波形蛋白是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要蛋白［13］。直接或間接地參與了血睪屏障的調(diào)控。研究［14］表明：當(dāng)波形蛋白表達(dá)異常時(shí)，支持細(xì)胞骨架出現(xiàn)變形甚至消失，最終改變血睪屏障的通透性。波形蛋白表達(dá)的改變是鑒定早期睪丸毒性效應(yīng)的重要指標(biāo)之一［15］。本研究結(jié)果顯示：大鼠睪丸波形蛋白表達(dá)水平隨香煙煙霧暴露時(shí)間和劑量的增加而逐漸降低。該結(jié)果與以往的睪丸毒性損傷研究結(jié)果一致，郭海等［16］研究表明：金屬錳誘導(dǎo)后的大鼠睪丸波形蛋白的表達(dá)下調(diào)，睪丸的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。PRIHATNO等［17］研究表明：給Wistar大鼠注射順鉑后，大鼠睪丸曲細(xì)精管嚴(yán)重?fù)p傷，波形蛋白和角蛋白等表達(dá)明顯下調(diào)。以上結(jié)果均證實(shí)：當(dāng)外源化學(xué)物刺激并長(zhǎng)期作用于機(jī)體時(shí)，可能會(huì)造成睪丸波形蛋白表達(dá)的改變，致使睪丸支持細(xì)胞骨架發(fā)生改變，最終影響睪丸的正常功能。

圖4 各組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of testicular TM 4 cells of rats in various groups

抑制素B來(lái)源于支持細(xì)胞，是反映支持細(xì)胞功能的重要內(nèi)分泌標(biāo)志物。抑制素B在睪丸生精過(guò)程中主要通過(guò)旁分泌作用調(diào)節(jié)支持細(xì)胞功能［18-19］。馬帥［20］通過(guò)Meta分析證實(shí)：血漿抑制素B在臨床上可作為非梗阻性無(wú)精子癥患者睪丸生精功能的良好預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示：睪丸支持細(xì)胞合成分泌的抑制素B水平在長(zhǎng)期香煙煙霧暴露后明顯降低，且呈現(xiàn)出一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系，此結(jié)果與王程強(qiáng)等［21］研究結(jié)果一致。上述研究結(jié)果均提示：長(zhǎng)期大量吸煙可能導(dǎo)致睪丸支持細(xì)胞功能損傷。本研究進(jìn)一步對(duì)支持細(xì)胞做體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：香煙煙霧暴露后，支持細(xì)胞增殖率明顯降低，同時(shí)凋亡率和細(xì)胞毒性明顯升高。均證實(shí)大量長(zhǎng)期香煙煙霧暴露對(duì)睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)生的毒性損傷是不可逆的，其中的具體調(diào)控機(jī)制本課題組將在未來(lái)的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

miRNA參與生物體細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)過(guò)程［5，22］，并作為重要的表觀遺傳因子在雄性生物睪丸的正常發(fā)育和精子發(fā)生過(guò)程的調(diào)控中發(fā)揮作用［23-24］。然而與吸煙所致睪丸毒性相關(guān)的miRNA及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因此本課題組前期采用miRNA高通量芯片測(cè)序技術(shù)篩選出了5條在香煙煙霧暴露后睪丸組織差異性表達(dá)的miRNA。對(duì)差異性miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能分析后，本課題組最終選擇表達(dá)差異倍數(shù)較大且預(yù)測(cè)具有靶基因的miR-138-5p進(jìn)行后續(xù)研究。本研究中采用RT-qPCR法對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)不同暴露周期香煙暴露組大鼠睪丸TM 4細(xì)胞中miR-138-5p的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果與芯片結(jié)果一致，即香煙煙霧暴露后睪丸組織中miR-138-5p的表達(dá)水平降低，且呈現(xiàn)一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。結(jié)合本課題組過(guò)往研究［25］的結(jié)果顯示：香煙煙霧暴露后睪丸TM 4細(xì)胞中miR-138-5p的表達(dá)下調(diào)與睪丸細(xì)胞損傷的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明miR-138-5p可能在香煙煙霧暴露所致睪丸支持細(xì)胞損傷中扮演重要的調(diào)控作用。繼續(xù)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)這一假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證，首先在支持細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-138-5p，繼續(xù)香煙煙霧干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：香煙煙霧暴露后，過(guò)表達(dá)miR-138-5p的TM 4細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡情況均得到了有效緩解。

綜上所述，miR-138-5p在香煙煙霧暴露所致睪丸支持細(xì)胞損傷過(guò)程中具有重要調(diào)控機(jī)制，同時(shí)本研究結(jié)果為本課題組未來(lái)對(duì)于miR-138-5p的具體分子調(diào)控機(jī)制的研究提供了依據(jù)。