曲海新,袁二偉,郭衛(wèi)平,張雅靜,馬文霞,吳 丹

（1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院新生兒科，河北 張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院兒科，河北 張家口 075000）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是常見的肺部炎性疾病，肺部感染、創(chuàng)傷和膿毒癥等是ARDS的主要致病因素，其臨床特征為低氧血癥、肺水腫及進行性呼吸衰竭等，是造成重癥監(jiān)護室患者死亡的重要原因［1-2］。肺實質彌漫性炎癥和強烈的氧化應激是ARDS的主要發(fā)病機制，減輕炎癥并降低氧化應激水平是其有效的治療策略［3-4］。木犀草素是一種具有較強抗菌、抗氧化和抗炎等藥理活性的天然黃酮類化合物，廣泛存在于木犀草、黃芩、紫蘇和金銀花等藥材中，可上調抗氧化基因的表達，通過抗炎及抗氧化作用減輕膿毒癥誘導的急性肺損傷［5］，木犀草素還是治療ARDS的中藥方劑清肺承氣湯的重要起效成分［6］，因而推測木犀草素對ARDS可能有很好的防治作用。NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體作為引發(fā)炎癥的重要信號分子，在各種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要調控作用，活性氧（reactive oxygen species，ROS）和硫氧還蛋白結合蛋白（thioredoxin binding protein，TXNIP）是NLRP3上游調節(jié)分子，降低其表達水平，可抑制NLRP3信號激活，減輕炎癥，改善肺組織損傷，因而ROS/TXNIP/NLRP3信號能作為ARDS的重要治療靶點［7-9］。本研究構建ARDS小鼠模型，探討木犀草素調控ROS/TXNIP/NLRP3信號通路對ARDS小鼠的保護作用，為ARDS的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器BALB/c雄性小鼠購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK（豫）2020－0005，SPF級，體質量為20～22 g。分籠飼養(yǎng)于本院動物中心，動物房溫度為21℃～25℃，相對濕度為50%～55%，照明12 h/12 h明暗交替循環(huán)，動物實驗符合3R原則。木犀草素（批號724C021）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（批號320V 0319）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性檢測試劑盒、HE染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（PC0020）、小鼠白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒、高效RIPA裂解液（R0010）、小鼠白細胞介素18（interleukin-18，IL-18）ELISA試劑盒和小鼠腫瘤壞 死 因 子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（SEKM-0034）購自北京索萊寶科技有限公司，組織ROS檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，鄰苯三酚（pyrogallol，PG）購自美國Selleck公司，兔源GAPDH一抗、兔源NLRP3一抗、兔源caspase-1一抗、兔源caspase-4一抗、兔源TXNIP一抗和羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。動物血氣分析儀（型號GEM 3500）購自上海玉研科學儀器有限公司，肺功能檢測儀（型號S-980A I）購自四川思科達科技有限公司，電子天平（型號BSA 224S-CW）購自德國Sartorius公司，酶標儀（型號Spectra Max M 2/M 2e）購自美國Molecular device公司，倒置熒光顯微鏡（型號DMI3000B）和冰凍切片機（型號CM 3050S）購自德國Leica公司，多樣品組織勻漿機（型號Tissuelyser-192）購自上海凈信公司，垂直電泳槽（型號VE180）、轉移電泳槽（型號VE 186）和電泳儀（型號EPS300）購自上海天能科技有限公司，凝膠成像儀（型號ChemiDoc XRS＋）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 ARDS小鼠模型制備和動物分組ARDS模型制備方法參考文獻［10］：將LPS加入0.9%氯化鈉溶液中溶解混勻配置為4.3 mg·kg－1，向小鼠氣管中滴注LPS溶液，翻轉小鼠并抬起其頭顱，使藥液均勻進入其兩肺中，約6 h后觀察小鼠行為，若其出現(xiàn)精神萎靡不振，食欲減退，少動，呼吸急促等癥狀，提示ARDS模型構建成功。將模型小鼠隨機分為模型組、木犀草素組、PG組和木犀草素+PG組，每組12只；另選出12只小鼠作為對照組，給予氣管滴注等量生理鹽水。將木犀草素和PG加入生理鹽水中溶解混勻，分別制成2 g·L－1木犀草素［11］藥液、7.5 g·L－1PG［12］溶液、木犀草素（2 g·L－1）及PG（7.5 g·L－1）的混合藥液，藥物干預組小鼠以10 mL·kg－1木犀草素藥液、PG溶液、木犀草素及PG的混合藥液分組腹腔注射，使木犀草素的劑量達到20 mg·kg－1，PG的劑量達到75 mg·kg－1，模型組和對照組小鼠均腹腔注射10 mL·kg－1生理鹽水，每天注射1次，共進行5 d。

1.3 各組小鼠肺功能檢測和標本收集各組小鼠于藥物處理結束后24 h，以小動物肺功能檢測儀測定呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）、吸氣阻力（resistance inspiratory，Ri）和每分鐘通氣量（minute ventilation，MV）值，作為評判小鼠肺功能的指標。然后頸椎脫臼處死小鼠，自頸動脈取血1.3 mL，取0.6 mL血進行動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）檢測，剩余血液經離心后，吸出上清保存于－80℃環(huán)境中；小鼠開胸取出雙肺，右肺組織行濕質量／干質量（wet weight/dry weight，W／D）比值測定，左肺組織中剪下約0.9 g組織保存于液氮中，再剪下0.3 g組織采用單細胞懸液制備儀制備單細胞懸液，剩余肺組織漂洗后，浸沒在包埋劑中，以液氮快速冰凍成塊后，采用冰凍切片機做常規(guī)病理切片備用。

1.4 各組小鼠PaO 2和肺W/D比值的檢測將“1.3”步驟中的小鼠動脈血置于小動物血氣分析儀中，測定其PaO2值。稱量“1.3”步驟中的小鼠右肺濕質量，然后置入烘烤箱中脫水，稱量其干質量，計算W/D比值。

1.5 各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)觀察取出“1.3”步驟中的肺組織冰凍切片，復溫后，浸入冰丙酮中固定，采用試劑盒參照其說明書行HE染色，蒸餾水漂洗后切片，采用顯微鏡觀察各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)并拍照，每張切片任意采集5個視野。

1.6 各組小鼠肺組織中ROS、GSH-Px、CAT水平及血清IL-18、IL-1β、TNF-α水平檢測取“1.3”步驟中制備的各組小鼠肺組織單細胞懸液，根據(jù)ROS測定試劑盒說明書步驟檢測肺組織中ROS水平。取出“1.3”步驟中保存在液氮中的肺組織，置于高效RIPA裂解液中，通過組織勻漿機制備成勻漿液，4℃離心后采用BCA法檢測其蛋白總濃度，取出0.1 mL，采用試劑盒參照其說明書步驟檢測肺組織中GSH-Px及CAT水平。取出“1.3”步驟中保存在－80℃中的血清，以冰水浴提取解凍后，采用試劑盒參照其說明書步驟檢測血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平。

1.7 各組小鼠肺組織中TXNIP/NLRP3通路相關蛋白TXNIP、caspase-1、caspase-4和NLRP3表達水平檢測取肺組織蛋白樣品液，100℃煮沸5 min，蛋白變性后，各組取20μg總蛋白，于120 V恒壓下電泳1 h，使蛋白分離后，通過濕轉（40 mA、75 min）將其轉移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉溶液室溫孵育1.5 h，以薄刀片將目的蛋白TXNIP、caspase-1、caspase-4和NLRP3自膜上裁下，以相對應的兔源一抗孵育（4℃、10 h），TBST洗膜（3次、每次5 min），以羊抗兔二抗孵育（室溫、1.5 h），洗膜（3次、每次5 min，TBST），ECL顯色，拍照后采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠MV、PEF、Ri、W/D比值和PaO2，血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平，肺組織中GSH-Px、CAT和ROS水平及TXNIP、caspase-1、caspase-4和NLRP3蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠MV、PEF和Ri與對照組比較，模型組小鼠MV和PEF均降低（P＜0.05），Ri升高（P＜0.05）。與模型組比較，木犀草素組小鼠MV及PEF升高（P＜0.05），Ri降低（P＜0.05）；與模型組比較，PG組小鼠MV和PEF降低（P＜0.05），Ri升高（P＜0.05）；與PG組比較，木犀草素+PG組小鼠MV和PEF升高（P＜0.05），Ri降低（P＜0.05）；與木犀草素組比較，木犀草素組小鼠MV和PEF降低（P＜0.05），Ri升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠MV、PEF和RiTab.1 MV,PEF,and Riof mice in various groups(n=12，±s）

表1 各組小鼠MV、PEF和RiTab.1 MV,PEF,and Riof mice in various groups(n=12，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs PG group；○P＜0.05 vs luteolin group.

Ri（kPa.s·L－1）25.05±2.52 60.13±6.68*79.85±7.18△25.21±2.63△59.98±7.04#○Group Control Model PG Luteolin Luteolin+PG MV（V/mL）7.71±0.68 2.82±0.35*1.15±0.13△7.66±0.74△2.85±0.42#○PEF（mL·s－1）62.45±6.56 39.38±3.43*20.84±2.12△62.17±6.26△39.42±3.78#○

2.2 各組小鼠W/D比值和PaO 2與對照組比較，模型組小鼠W/D比值升高（P＜0.05），PaO2降低（P＜0.05）。與模型組比較，木犀草素組小鼠W/D比值降低（P＜0.05），PaO2升高（P＜0.05）；PG組小鼠W/D比值升高（P＜0.05），PaO2降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠W/D比值和PaO 2Tab.2 W/D ratios and PaO 2 of mice in various groups(n=12，±s）

表2 各組小鼠W/D比值和PaO 2Tab.2 W/D ratios and PaO 2 of mice in various groups(n=12，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs PG group；○P＜0.05 vs luteolin group.

PaO2（P/mmHg）98.79±9.67 55.86±4.18*37.08±3.27△98.57±10.23△56.01±6.24#○Group Control Model PG Luteolin Luteolin+PG W/D 4.42±0.39 6.78±0.56*8.65±0.61△4.55±0.33△6.74±0.70#○

2.3 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學表現(xiàn)對照組小鼠肺泡結構清晰完好，肺間質無水腫和炎性細胞浸潤，肺組織無損傷；模型組小鼠肺泡壁變厚，肺泡塌陷變形，肺間質水腫伴有大量炎性細胞浸潤，肺組織有嚴重病理損傷；與模型組和木犀草素+PG組比較，木犀草素組小鼠上述肺組織損傷均明顯改善；PG組小鼠上述肺組織損傷均明顯加重。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×400）Fig.1 Pathomorphology of lung tissue of mice in various groups(HE,×400)

2.4 各組小鼠肺組織中GSH-Px和CAT水平與對照組比較，模型組小鼠肺組織中GSH-Px和CAT水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，木犀草素組小鼠肺組織中GSH-Px和CAT水平均升高（P＜0.05），PG組小鼠肺組織中GSH-Px和CAT水平均降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肺組織中GSH-Px和CAT水平Tab.3 Levels of GSH-Px and CAT in lung tissue of mice in various groups [n=12，x±s，λB/（U·mg－1）］

2.5 各組小鼠血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平與對照組比較，模型組小鼠血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，木犀草素組小鼠血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平均降低（P＜0.05），PG組小鼠血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平均升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平Tab.4 Levels of serum IL-18,IL-1β,and TNF-αof mice in various groups (n=12，±s）

表4 各組小鼠血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平Tab.4 Levels of serum IL-18,IL-1β,and TNF-αof mice in various groups (n=12，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs luteolin+PG group；○P＜0.05 vs luteolin group.

TNF-α[ρB/（μg·L－1）]0.42±0.10 1.47±0.28*2.30±0.32△0.44±0.11△1.45±0.23#○Group Control Model PG Luteolin Luteolin+PG IL-18[ρB/（μg·L－1）]0.32±0.07 1.15±0.18*1.90±0.23△0.33±0.08△1.13±0.24#○IL-1β[ρB/（ng·L－1）]21.93±4.81 67.41±9.32*98.72±11.48△22.01±5.84△67.37±10.56#○

2.6 各組小鼠肺組織中ROS水平和TXNIP、caspase-1、caspase-4及NLRP3蛋白表達水平與對照組比較，模型組小鼠肺組織中ROS水平和TXNIP、caspase-1、caspase-4及NLRP3蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，木犀草素組小鼠肺組織中ROS水平和TXNIP、caspase-1、caspase-4及NLRP3蛋白表達水平均降低（P＜0.05），PG組小鼠肺組織中ROS水平和TXNIP、caspase-1、caspase-4及NLRP3蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。見圖2和表5。

表5 各組小鼠肺組織中ROS水平和TXNIP、caspase-1、caspase-4及NLRP3蛋白表達水平Tab.5 Levels of ROS and expression levels of TXNIP,caspase-1,caspase-4,and NLRP3 proteins in lung tissue of mice in various groups （n=12，±s）

表5 各組小鼠肺組織中ROS水平和TXNIP、caspase-1、caspase-4及NLRP3蛋白表達水平Tab.5 Levels of ROS and expression levels of TXNIP,caspase-1,caspase-4,and NLRP3 proteins in lung tissue of mice in various groups （n=12，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs PG group；○P＜0.05 vs luteolin group.

Group Control Model PG Luteolin Luteolin+PG ROS[（U·kg－1）]1.65±0.21 5.06±0.35*7.61±0.64△1.69±0.24△5.01±0.32#○caspase-4/GAPDH 0.60±0.13 1.34±0.25*2.12±0.31△0.64±0.18△1.31±0.20#○TXNIP/GAPDH 0.39±0.07 1.15±0.29*1.86±0.35△0.41±0.09△1.14±0.21#○caspase-1/GAPDH 0.51±0.12 1.49±0.28*2.31±0.35△0.53±0.19△1.47±0.24#○NLRP3/GAPDH 0.43±0.08 1.32±0.23*2.01±0.37△0.45±0.11△1.30±0.22#○

圖2 各組小鼠肺組織中TXNIP、caspase-1、caspase-4及NLRP3蛋白表達電泳圖Fig. 2 Electrophoregram of expressions of TXNIP,caspase-1,caspase-4,and NLRP3 proteins in lung tissue of mice in various groups

3 討 論

ARDS作為一種炎性細胞活化失控導致的嚴重肺部炎性疾病，臨床治療以機械通氣、控制原發(fā)病和液體管理等手段為主，但療效并不理想，病死率仍高達40%左右，極大威脅人類生命安全，探尋更為有效的治療方法具有重大臨床意義［13-14］。本研究采用氣管滴注LPS溶液的方法建立ARDS小鼠模型的結果顯示：LPS可誘導炎性介質ROS、IL-18、IL-1β和TNF-α大量產生，降低抗氧化因子GSH-Px和CAT的水平，引起劇烈的肺內炎癥及氧化應激，造成肺泡壁變厚，肺泡塌陷變形，大量炎性細胞浸潤肺間質，導致小鼠發(fā)生嚴重肺水腫，肺功能指標Ri明顯升高，MV、PEF和PaO2明顯降低，表明LPS造成了嚴重的肺功能損傷，表示ARDS模型建立成功。

ARDS患者在各種內外因素刺激下，體內抗炎因子與促炎因子表達失衡，引發(fā)強烈的炎性細胞因子風暴，造成肺部嚴重的炎癥和過氧化損傷，是其主要致病基礎，減輕炎癥和過氧化反應可抑制肺上皮細胞凋亡，是改善ARDS患者肺泡毛細血管通透性 及 肺 損 傷 的 有 效 策 略［15-16］。研 究［17-19］顯 示：木犀草素作為一種天然抗炎和抗氧化化合物，可抑制NLRP3炎性小體表達，減輕關節(jié)炎癥，還可降低哮喘幼鼠氣道炎癥因子水平，阻礙炎癥發(fā)生發(fā)展，改善其肺組織損傷，因而可推測木犀草素可能通過抑制炎癥而治療ARDS。本研究采用木犀草素處理ARDS小鼠發(fā)現(xiàn)：木犀草素可清除ROS，降低血清炎性因子IL-18、IL-1β和TNF-α水平，抑制肺組織炎癥及氧化應激反應，緩解肺水腫，提高肺組織中抗氧化酶GSH-Px及CAT水平，降低肺功能指標Ri，升高MV、PEF和PaO2，減輕肺損傷，修復肺功能，改善ARDS癥狀，提示木犀草素可阻礙肺內過氧化和炎癥反應，改善肺功能損傷，本研究結果證實了木犀草素對ARDS具有很好的治療作用。

ROS是引發(fā)機體強烈炎癥及過氧化反應的重要信號分子，可促進TXNIP和NLRP3表達，激活炎性細胞，促使致炎因子分泌，參與介導各種因素所致的急性肺損傷的發(fā)病及進展過程，減少ROS釋放，下調TXNIP及NLRP3蛋白表達，可減弱LPS誘導的氧化應激和炎性細胞風暴，緩解肺組織炎癥及過氧化損傷，最終減輕急性肺損傷癥狀，由此可知，ROS/TXNIP/NLRP3信號是很有前景的ARDS治療靶點［20-22］。本研究采用ROS誘導劑PG處理ARDS小鼠，發(fā)現(xiàn)其可上調TXNIP和NLRP3表達，促進炎癥及氧化應激進展，加重肺組織及肺功能損傷，表明ROS/TXNIP/NLRP3信號參與介導ARDS的致病過程，以木犀草素治療ARDS小鼠，可降低ARDS小鼠ROS水平及TXNIP、caspase-1和NLRP3蛋白表達水平，表明木犀草素可抑制ROS/TXNIP/NLRP3信號激活，而以ROS誘導劑PG和木犀草素聯(lián)合處理ARDS小鼠時，PG可減弱木犀草素對小鼠肺部炎癥及氧化應激的抑制作用，并降低木犀草素對小鼠肺組織及肺功能的保護作用，表明木犀草素是通過下調ROS/TXNIP/NLRP3表達從而減輕肺部炎癥與氧化應激和緩解小鼠肺損傷并改善其肺功能的。

綜上所述，木犀草素可明顯減少各種致病因素引發(fā)的ROS及炎性細胞因子過度釋放，明顯減弱炎性細胞因子風暴，阻礙炎癥發(fā)生發(fā)展，降低氧化應激水平，緩解ARDS小鼠雙肺病理損傷，修復其肺功能，阻滯ROS/TXNIP/NLRP3信號傳導是木犀草素治療ARDS的作用機制之一。