萬朝輝,曾 良,周 輝,李 晶,雷長城

（1.南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421900；3.南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院心血管內科，湖南 衡陽 421001）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）發(fā)病急且快，是外科常見的腹部急性炎癥疾病，主要表現(xiàn)為胰腺缺血和壞死，同時引發(fā)全身多器官損傷，致死率極高。常見的SAP并發(fā)癥為急性肺損傷，SAP患者病死率高的主要原因之一是并發(fā)肺損傷［1-2］。因此探討SAP的發(fā)病機制，對于預防和治療SAP患者肺損傷至關重要。重樓為百合科重樓屬植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖，是一種珍貴的中藥材，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌抑菌、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、止血和免疫調節(jié)等作用，對肺部炎癥疾病具有一定的治療效果［3-4］。但有關重樓在SAP引發(fā)肺損傷中的作用目前尚未見相關報道。甾體皂苷是重樓的主要活性成分，本研究選取重樓皂苷Ⅶ（polyphyllinⅦ，PPⅦ）對SAP肺損傷大鼠進行治療，觀察其對SAP大鼠肺組織損傷的改善作用并探討其可能的作用機制，為SAP的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器75只SPF級SD大鼠，雄性，8周齡，體質量（250±20）g，由南華大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2015-0002。飼養(yǎng)溫度15℃～25℃，相對濕度45%～55%，保持環(huán)境清潔。大鼠適應性喂養(yǎng)1周，術前12 h禁食，自由飲水。PPⅦ購自四川維克奇生物科技有限公司（生產(chǎn)批號：180907，純度≥98%），?；悄懰徕c購自美國Sigma公司（批號：BCBF3394V），二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒和HE染色試劑盒購自上海碧云天公司，脂肪酶和淀粉酶ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白 細 胞 介 素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，核因子-κB抑制因子α（inhibitor of nuclear factor-κBα，IκBα）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65、磷酸 化NF-κB（phosphorylated NF-κB，p-NF-κB）p65（Ser536）和GAPDH抗體均購自美國CST公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒和洗膜緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司。全自動血氣分析檢測儀購自美國Beckman公司，全自動酶標儀購自美國Bio-Tek公司，全自動顯微鏡購自日本Nikon公司，蛋白凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 動物分組、造模和給藥75只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、地塞米松組（陽性對照，2 mg·kg－1地塞米松）、低劑量PPⅦ組（50 mg·kg－1PPⅦ）和PPⅦ高劑量組（150 mg·kg－1PPⅦ），每組15只。除假手術組外，其他各組大鼠采用逆行胰膽管注射5%牛磺膽酸鈉溶液（劑量：0.1 mL·100 g－1，流 速：0.2 mL·min－1）法 建 立SAP模型［5］，約15 min后觀察到胰腺水腫伴有出血，提示SAP大鼠模型制備成功，隨后將血管夾取下，關閉腹腔并縫合。假手術組大鼠開腹后僅翻動腸管和膽胰管，術后所有大鼠均自由飲水飲食。造模成功后開始給藥干預，低和高劑量PPⅦ組大鼠分別給予50和150 mg·kg－1PPⅦ腹腔注射，地塞米松組大鼠腹腔注射2 mg·kg－1地塞米松，假手術組和模型組大鼠注射等量生理鹽水，各組大鼠給藥均為每天1次，連續(xù)2 d，隨后處死大鼠取材。

1.3 各組大鼠動脈血中氧合指數(shù)（oxygenation index，OI）測定給藥2 d后，抽取500μL動脈血，置于添加肝素的抗凝管中，采用全自動血氣分析檢測儀進行血氣分析和記錄各組大鼠動脈血氧分壓（partial pressure of O2，PaO2），根據(jù)吸入氣中的氧濃度分數(shù)（fraction of inspiration O2，F(xiàn)iO2），計算OI，OI=PaO2/FiO2。

1.4 各組大鼠肺組織濕/干質量（wet weight/dry weight，W/D）比值計算取各組大鼠右肺下葉置于濾紙上，使表面水分被充分吸干，采用電子分析天平稱濕質量（W），隨后置于烘箱中烘烤72 h，溫度為80℃，待烘至恒定重量后取出稱干質量（D），計算肺組織W/D比值。

1.5 ELISA法檢測各組大鼠血清脂肪和淀粉酶水平及肺泡灌洗液（BALF）中炎癥因子水平實驗結束后取各組大鼠眶靜脈血，3 000 r·min－1離心10 min，取上清液保存待測。同時將大鼠的右主支氣管結扎，采用提前預冷的PBS灌洗肺泡，重復5次收集BALF，隨后置入－20℃冰箱保存待用。采用ELISA法檢測各組大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平及BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-18水平，參考試劑盒說明書步驟操作，采用酶標儀測定各孔吸光度（A）值，波長設為450 nm，制作標準曲線并根據(jù)標準曲線計算相應指標。

1.6 HE染色觀察各組大鼠胰腺和肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)取大鼠胰腺及左肺組織，置于10%多聚甲醛中固定，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋后制備石蠟切片并使厚度為3～4μm，隨后將石蠟切片置于60℃烤箱中2 h后取出進行脫蠟和水化，采用HE染色試劑盒對切片進行染色，在顯微鏡下觀察各組大鼠胰腺和肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)。從胰腺水腫、壞死和炎癥細胞浸潤等方面對胰腺組織損傷程度進行評分，評分標準參考Schmidt病理學評分［6］，損傷程度由輕到重依次標記為0、1、2、3和4分，累計總分為最終損傷評分。從肺組織水腫、出血和炎癥浸潤等病理改變情況對肺組織損傷程度進行評分，評分標準參考Holfbauer評分［7］，損傷程度由輕到重依次標記為0、1、2、3和4分，累計總分為最終損傷評分。

1.7 Western blotting法檢測各組大鼠肺組織中NF-κB信號通路相關蛋白表達水平收集各組大鼠左肺組織，配置蛋白裂解液并提前置入4℃冰箱預冷，取約1 g肺組織剪碎后加入裂解液，勻漿機制備勻漿液，4℃、4 000 r·min－1離心20 min后取上清液，BCA法進行蛋白定量，取相同質量的蛋白與上樣緩沖液混合，SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜，室溫以5%的脫脂奶粉封閉2 h后分別加入相應一抗IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65和GAPDH于4℃孵育過夜，TBST溶液漂洗后室溫孵育羊抗兔二抗2 h，TBST漂洗后采用化學發(fā)光試劑顯色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度值分析，以GAPDH為內參計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠動脈血OI值，肺組織W/D比值，血清脂肪酶和淀粉酶水平，BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，肺組織中IκBα、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠動脈血OI值和肺組織W/D比值與假手術組比較，模型組大鼠動脈血OI值明顯降低（P＜0.01），肺組織W/D比值明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組和高劑量PPⅦ組大鼠動脈血OI值明顯升高（P＜0.01），肺組織W/D比值明顯降低（P＜0.01），而低劑量PPⅦ組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠動脈血OI值和肺組織W/D比值Tab.1 OI values of arterial blood and W/D ratios of lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

表1 各組大鼠動脈血OI值和肺組織W/D比值Tab.1 OI values of arterial blood and W/D ratios of lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

*P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.01 v s model group.

Group Sham operation Model Dexamethasone Low dose of PPⅦHigh dose of PPⅦW/D ratio 4.27±0.81 6.30±0.95*4.65±0.75△6.11±0.79 5.02±0.61△OIvalue（P/mmHg）440.59±19.93 264.85±12.08*411.38±13.55△280.86±9.06 376.59±12.54△

2.2 各組大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平與假手術組比較，模型組大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量PPⅦ組和地塞米松組大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平明顯降低（P＜0.01），而低劑量PPⅦ組大鼠上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠血清脂肪酶(A)和淀粉酶(B)水平Fig.1 Levels of lipase(A)and amylase(B)in serum of rats in various groups

2.3 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平與假手術組比較，模型組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量PPⅦ組和地塞米松組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低（P＜0.01），而低劑量PPⅦ組大鼠上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠BALF中IL-1β(A)、IL-6(B)和TNF-α(C)水平Fig.2 Levels of IL-1β(A),IL-6(B)and TNF-α(C)in BALF of rats in various groups

2.4 各組大鼠胰腺和肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)假手術組大鼠胰腺組織細胞正常，未見明顯異常；模型組和低劑量PPⅦ組大鼠胰腺組織水腫、腺泡細胞出現(xiàn)大量壞死并伴有大量炎癥細胞浸潤；高劑量PPⅦ組和地塞米松組大鼠胰腺組織炎癥表現(xiàn)均得到明顯改善。假手術組大鼠肺泡結構完整，肺組織未發(fā)生水腫和炎性細胞浸潤；模型組和低劑量PPⅦ組大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡壁變厚、間隔變大，肺間質充血、水腫并伴隨大量炎性細胞浸潤等損傷癥狀；高劑量PPⅦ組和地塞米松組大鼠肺組織損傷程度得到明顯改善。與假手術組比較，模型組大鼠胰腺組織和肺組織病理評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組和高劑量PPⅦ組大鼠胰腺組織和肺組織病理評分明顯降低（P＜0.01），而低劑量PPⅦ組大鼠胰腺組織和肺組織病理評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3、圖4和表2。

表2 各組大鼠胰腺組織和肺組織病理評分Tab.2 Pathological scores of pancreas tissue and lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

表2 各組大鼠胰腺組織和肺組織病理評分Tab.2 Pathological scores of pancreas tissue and lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

*P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.01 v s model group.

Group Sham operation Model Dexamethasone Low dose of PPⅦHigh low dose of PPⅦPathological score Pancreas tissue 0.44±0.15 9.65±0.60*4.25±0.18△8.94±0.51 5.85±0.44△Lung tissue 0.35±0.11 7.78±0.53*3.88±0.20△7.02±0.65 4.12±0.39△

圖3 各組大鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.3 Pathomorphology of pancreas tissue of rats in various groups（HE,×200）

圖4 各組大鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.4 Pathomorphology of lung tissue of rats in various groups（HE,×200）

2.5 各組大鼠肺組織中NF-κB信號通路相關蛋白表達水平與假手術組比較，模型組大鼠肺組織中IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組和高劑量PPⅦ組大鼠肺組織中IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），而低劑量PPⅦ組大鼠上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠肺組織中NF-κB信號通路相關蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram（A）and histogram(B)of expressions of NF-κB signaling pathway related proteins in lung tissue of rats in various groups

3 討 論

目前臨床上治療SAP的藥物不良反應較多，并發(fā)癥較多，效果不顯著。近年來，中藥治療SAP已經(jīng)有了大量的探索和進展，且出現(xiàn)了許多新亮點，在臨床治療方面顯現(xiàn)出獨特優(yōu)勢［8-9］。重樓提取物能通過調節(jié)免疫活性物質和炎癥因子起到良好的抗炎作用［10-11］，這使得重樓皂苷治療SAP成為可能。有研究［12-13］顯示：當NF-κB被激活后機體炎癥反應爆發(fā)，各臟器組織被進一步損傷并參與肺損傷的發(fā)病機制，提示NF-κB信號通路可能是SAP肺損傷中極其重要的一個環(huán)節(jié)。本研究結果顯示：PPⅦ可通過抑制NF-κB信號通路的轉導，減輕肺部炎癥癥狀，改善SAP肺損傷大鼠的肺功能。

SAP發(fā)生后對胰腺的主要病理損傷表現(xiàn)為腺泡結構破壞和炎癥細胞大量浸潤等，本研究參考前期研究［14］采用逆行膽管注射?；悄懰徕c制備SAP大鼠模型，HE病理染色結果顯示模型大鼠胰腺組織腺泡細胞大量壞死，伴有大量炎性細胞浸潤，與胰腺炎的病理特征相似，提示SAP模型大鼠制備成功。本研究中肺組織HE染色結果顯示：模型組大鼠肺部還伴有肺泡壁增厚、肺間質水腫、間隔變寬及炎性細胞浸潤的病理特征，同時大鼠肺組織W/D比值升高、動脈血OI值明顯降低，表明SAP不僅引起大鼠胰腺組織損傷，還可誘發(fā)大鼠肺組織損傷，提示SAP肺損傷模型制備成功。進一步的研究結果顯示：給予高劑量PPⅦ治療SAP大鼠后，大鼠胰腺組織和肺組織損傷程度明顯降低，肺組織W/D比值降低，動脈血OI值升高，與陽性藥物地塞米松的治療效果相當，提示PPⅦ能改善SAP引發(fā)的肺損傷。

血清脂肪酶和淀粉酶水平是SAP的重要診斷指標。研究［15-16］顯示：SAP大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平均明顯高于正常組。在SAP的發(fā)病過程中，血液中的腸源性內毒素水平會在短時間內迅速升高，同時肺泡巨噬細胞會產(chǎn)生多種炎性因子，引發(fā)一系列的炎癥級聯(lián)瀑布反應［17］。毛崢嶸等［18］研究顯示：SAP患者血清TNF-α和IL-6水平明顯升高，治療后血清TNF-α和IL-6水平降低，提示肺損傷后的重要表現(xiàn)之一是伴隨大量中性細胞浸潤。本研究結果顯示：模型組大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯高于假手術組，提示SAP大鼠肺組織炎性損傷，而給予高劑量PPⅦ干預后，SAP大鼠血清脂肪酶和淀粉酶水平以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低，提示PPⅦ可能通過抑制肺組織炎性細胞浸潤，降低炎癥因子水平從而緩解肺組織損傷。

SAP多器官功能不全綜合征的關鍵始動因素是炎癥反應的爆發(fā)和失控，故治療SAP的關鍵點在于及時阻斷炎癥反應的發(fā)生。NF-κB作為調控炎癥反應的轉錄因子，可調控各種促炎基因的翻譯表達，其中p65是NF-κB介導促炎效應的一個主要亞基［19］。通常情況下核因子κB抑制因子（inhibitor of nuclear factor-κB，IκB）能 抑 制NF-κB，使NF-κB以非活性狀態(tài)存在于細胞質中，受到外界刺激后IκB發(fā)生磷酸化而被激活，對NF-κB抑制作用也解除，使其可以磷酸化后進入細胞核內，促進靶基因的轉錄［20-21］。本研究結果顯示：模型組大鼠肺組織中IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯高于假手術組，說明NF-κB信號通路被激活，與既往研究［22-23］結論一致，而給予高劑量PPⅦ治療后，大鼠肺組織中IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低，表明PPⅦ可能通過抑制NF-κB信號通路，降低肺組織中炎性細胞因子水平，從而發(fā)揮對SAP大鼠肺組織的保護作用。

綜上所述，PPⅦ可通過抑制NF-κB信號通路介導的促炎因子分泌，緩解SAP大鼠胰腺組織和肺組織損傷，從而發(fā)揮對SAP肺損傷的保護作用。