黃笑塵,李 浩,王保華,李 凱,3

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院麻醉科，吉林 長(zhǎng)春 130033）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是影響全球老年人的排名第二位的常見進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。研究［2-3］顯示：截至2005年，全球有接近460萬人受到PD的影響；預(yù)計(jì)到2030年，PD發(fā)病人數(shù)可能增至900萬以上。PD為多種內(nèi)在因素和外界環(huán)境因素交互導(dǎo)致的級(jí)聯(lián)反應(yīng)所致，是α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）的積聚、氧化應(yīng)激的產(chǎn)生、線粒體功能缺陷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激障礙、神經(jīng)炎癥產(chǎn)生和鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡及單胺氧化酶B（monoamine oxidase B，MAO-B）活性降低等多種病理生理機(jī)制共同參與的機(jī)制過程［4-9］。研究［10］顯示：Wnt/β連環(huán)蛋白（β-catenin）通路與PD之間存在一定的聯(lián)系，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可使多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)再生，在PD小鼠模型中激活該通路可以延緩PD的發(fā)生發(fā)展［11］。利多卡因是一種酰胺類局部麻醉藥，可用于區(qū)域麻醉和靜脈治療室性心律失常。利多卡因不僅具有抗炎特性，還具有鈉通道阻滯作用，所以廣泛應(yīng)用于臨床圍手術(shù)期。近年來有研究者［12-13］發(fā)現(xiàn)：利多卡因在圍手術(shù)期可以減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，并發(fā)揮一定的保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不明確。本研究采用1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）作用于PC12細(xì)胞建立體外PD模型，給予細(xì)胞利多卡因的同時(shí)給予Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑重組dickkopf-1（DKK 1）蛋白抑制該通路，探討利多卡因是否通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路在氧化應(yīng)激引起的PD損傷中起到保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（以色列BI公司），CCK-8試劑（美國(guó)APEx BIO公司），活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物公司），ECL發(fā)光試劑盒（上海莫納生物科技有限公司），Wnt配體蛋白1（Wnt ligand protein 1，Wnt1）、磷酸化糖原合成酶激酶3β（phosphorylated-glycogen synthase kinase-3β，p-GSK-3β）抗體（愛博泰克生物科技有限公司），β-catenin、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）抗體和DKK 1抑制劑（美國(guó)Abcam公司），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic acid protease 3，caspase 3）和GAPDH抗體（美國(guó)Proteintech公司），MPTP（美國(guó)Sigma公司），鹽酸利多卡因注射液（遂成藥業(yè)股份有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（上海莫納生物有限公司）。凝膠電泳系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)和實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞采用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代和凍存。

1.3 CCK-8法確定MPTP的處理濃度和時(shí)間將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種至96孔板中，并采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。MPTP處理時(shí)將PC12細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組（0 mmol·L－1MPTP）和不同 濃 度（0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 mmol·L－1）MPTP組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6、12、24和48 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在每孔中加入10μL CCK-8溶液，混勻，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，然后輕輕振蕩混勻，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=［（實(shí)驗(yàn)孔A值－空白孔A值）/（對(duì)照孔A值－空白孔A值）］×100%。

1.4 CCK-8法和Western blotting法確定利多卡因的處理濃度和時(shí)間將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種至96孔板中，并采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。利多卡因處理時(shí)將PC12細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組（0 g·L－1利多卡因）和不同濃度（0.001、0.010、0.100、0.200、0.400、0.600、0.800和1.000 g·L－1）利多卡因組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、2、6、12和24 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在每孔中加入10μL CCK-8溶液，混勻，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，然后輕輕振蕩混勻，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=［（實(shí)驗(yàn)孔A值－空白孔A值）/（對(duì)照孔A值－空白孔A值）］×100%。

Western blotting法確定利多卡因最佳濃度時(shí)將PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、MPTP組、MPTP+0.2 g·L－1利多卡因組、MPTP+0.6 g·L－1利多卡因組和MPTP+1.0 g·L－1利多卡因組。

1.5 PC12細(xì)胞分組確定MPTP和利多卡因濃度后將細(xì)胞分為對(duì)照組、MPTP組、MPTP+利多卡因組、MPTP+利多卡因+DKK1組和MPTP+DKK1組。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組PC12細(xì)胞中ROS水平PC12細(xì)胞經(jīng)MPTP和利多卡因等一系列藥物處理后，采用無EDTA的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，于15 mL離心管中離心，棄上清，加入1 mL PBS重懸管底細(xì)胞，移入2 mL EP管中，根據(jù)ROS檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。ROS水平=實(shí)驗(yàn)組ROS陽性細(xì)胞百分率/對(duì)照組ROS陽性細(xì)胞百分率。

1.7 ELISA法檢測(cè)各組PC12細(xì)胞上清中炎癥因子表達(dá)水平按試劑盒要求加樣后，以空白孔調(diào)零，于450 nm波長(zhǎng)處依序測(cè)量各孔A值。擬合模型采用Logistic曲線（四參數(shù)）。根據(jù)ELISA試劑盒說明書計(jì)算各組細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。

1.8 RT-qPCR法檢測(cè)各組PC12細(xì)胞中Wnt1、β-catenin和GSK-3βmRNA表達(dá)水平采用總RNA提取試劑盒提取總RNA，并將樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，37℃溫育2 min、55℃溫育15 min、85℃溫育5 min。按照RT-qPCR試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，預(yù)變性95℃×10 min，變性95℃×10 s，退火55℃×10 s，延伸72℃×30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Tab.1 Primer sequences of target genes

1.9 Western blotting法檢測(cè)各組PC12細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3蛋白表達(dá)水平收集各組PC12細(xì)胞，采用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)細(xì)胞濃度，調(diào)整為統(tǒng)一濃度后100℃、5 min進(jìn)行蛋白變性，于－20℃保存。加入蛋白樣品進(jìn)行電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Wnt1、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3一抗（1∶1 000），4℃冰箱過夜；TBST溶液清洗3次后加入二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜后，加入ECL顯影液，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件分析目的蛋白表達(dá)水平，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Excel錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率，細(xì)胞中ROS水平，細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，細(xì)胞中Wnt1、β-catenin和GSK-3βmRNA表達(dá)水平，細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、GSK-3β、p-GSK3β和caspase 3蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNKq檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MPTP造模濃度和時(shí)間與正常組比較，0.2～3.2 mmol·L－1MPTP組細(xì)胞存活率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)MPTP濃度為0.8 mmol·L－1、作用時(shí)間為24 h時(shí)，細(xì)胞存活率為75%，因此，確定MPTP的造模濃度為0.8 mmol·L－1，時(shí)間為24 h。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞存活率Fig.1 Survival rates of PC12 cells in various groups

2.2 利多卡因最佳作用濃度和時(shí)間與對(duì)照組比較，PC12細(xì)胞存活率在給予0.001～1.000 g·L－1利多卡因作用6 h后明顯降低（P＜0.05）。當(dāng)利多卡因濃度為0.200 g·L－1時(shí)，P＜0.01；當(dāng)利多卡因濃度≥0.400 g·L－1時(shí)，P＜0.01。因此，本實(shí)驗(yàn)確定0.2 g·L－1為 低 濃 度，0.6 g·L－1為 中 濃 度，1.0 g·L－1為高濃度，再采用Western blotting法選取利多卡因最佳作用濃度為中濃度0.6 g·L－1。利多卡因作用6 h后，與對(duì)照組比較，MPTP和MPTP+0.200 g·L－1利多卡因組PC12細(xì)胞中Wnt1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），caspase 3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與MPTP組比較，MPTP+0.200 g·L－1利 多 卡 因、MPTP+0.600 g·L－1利 多 卡 因組和MPTP+1.000 g·L－1利多卡因組PC12細(xì)胞中Wnt1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），MPTP+0.600 g·L－1利 多 卡 因組和MPTP+1.000 g·L－1利多卡因組PC12細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與MPTP+0.200 g·L－1利 多 卡 因 組 比 較，MPTP+0.600 g·L－1利多卡因組PC12細(xì)胞中Wnt1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），caspase 3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），MPTP+1.000 g·L－1利多卡因組PC12細(xì)胞中Wnt1和caspase 3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與MPTP+0.600 g·L－1利 多 卡 因 組 比 較，MPTP+1.000 g·L－1利多卡因組PC12細(xì)胞中Wnt1和caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖2、圖3和表2。

圖3 利多卡因作用6 h后各組細(xì)胞中Wnt1和caspase 3蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of Wnt1 and caspase 3 proteins in cells in various groups after treated with lidocaine for 6 h detected by Western blotting method

表2 利多卡因作用6 h后各組PC12細(xì)胞中Wnt1和caspase 3蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of Wnt1 and caspase 3 proteins in PC12 cells in various groups after treated with lidocaine for 6 h(n=3，±s）

表2 利多卡因作用6 h后各組PC12細(xì)胞中Wnt1和caspase 3蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of Wnt1 and caspase 3 proteins in PC12 cells in various groups after treated with lidocaine for 6 h(n=3，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs MPTP group；#P＜0.05 vs MPTP+0.200 g·L－1 lidocaine group；○P＜0.05 vs MPTP+0.600 g·L－1 lidocaine group.

caspase 3 0.537±0.007 0.815±0.045*0.755±0.005*0.660±0.020△0.436±0.02△#○47.21＜0.01 Group Control MPTP MPTP+0.200g·L－1 lidocaine MPTP+0.600 g·L－1 lidocaine MPTP+1.000 g·L－1 lidocaine F P Wnt1 0.360±0.010 0.035±0.005*1.105±0.045*△1.575±0.055*△#0.630±0.008*△#○337.0＜0.01

圖2 利多卡因作用6 h時(shí)各組細(xì)胞存活率Fig.2 Survival rates of PC12 cells in various groups after treated with lidocaine for 6 h

2.3 各組細(xì)胞中ROS水平與對(duì)照組比較，MPTP組PC12細(xì)胞中ROS水平明顯升高（P＜0.05）；與MPTP組比較，MPTP+利多卡因組PC12細(xì) 胞 中ROS水 平 降 低（P＜0.05）；與MPTP+利多卡因組比較，MPTP+利多卡因+DKK1組PC12細(xì)胞中ROS水平升高（P＜0.05）。見圖4和表3。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組PC12細(xì)胞中ROS水平Fig.4 ROS levels in PC12 cells in various groups detected by flow cytometry

表3 各組PC12細(xì)胞中ROS水平Tab.3 ROS levels in PC12 cells in various groups(n=3，±s，η/%）

表3 各組PC12細(xì)胞中ROS水平Tab.3 ROS levels in PC12 cells in various groups(n=3，±s，η/%）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs MPTP group；#P＜0.05 vs MPTP+lidocaine group；○P＜0.05 vs MPTP+lidocaine+DKK1 group.

ROS level 1.215±0.005 7.875±0.935*1.47±0.050△3.005±0.035*△#4.390±0.090*△#○41.59＜0.01 Group Control MPTP MPTP+lidocaine MPTP+lidocaine+DKK 1 MPTP+DKK 1 F P

2.4 各組PC12細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平與對(duì)照組比較，MPTP組PC12細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高（P＜0.05）；與MPTP組比較，MPTP+利多卡因組PC12細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低（P＜0.05）；與MPTP+利多卡因組比較，MPTP+利多卡因+DKK 1組PC12細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組PC12細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平Tab.4 Levels of IL-1β,IL-6,and TNF-αin supernatant of PC12 cells in various groups [n=3,±s,ρB/(ng·L-1)]

表4 各組PC12細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平Tab.4 Levels of IL-1β,IL-6,and TNF-αin supernatant of PC12 cells in various groups [n=3,±s,ρB/(ng·L-1)]

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs MPTP group；#P＜0.05 vs MPTP+lidocaine group；○P＜0.05 vs MPTP+lidocaine+DKK1 group.

2.5 各 組 細(xì) 胞 中Wnt1、β-catenin和GSK-3β mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，MPTP組PC12細(xì)胞中Wnt1和β-catenin mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05），GSK-3βmRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與MPTP組比較，MPTP+利多卡因組PC12細(xì)胞中Wnt1和β-catenin mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），GSK-3βmRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組PC12細(xì)胞中Wnt1、β-catenin和GSK-3βmRNA表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of Wnt1,β-catenin,and GSK-3βm RNA in PC12 cells in various groups

2.6 各 組 細(xì) 胞 中Wnt1、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，MPTP組PC12細(xì)胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與MPTP組比較，MPTP+利多卡因組PC12細(xì)胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖6、圖7和表5。

表5 各組PC12細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3蛋白表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of Wnt1,β-catenin,GSK-3β,p-GSK-3β,and caspase 3 proteins in PC12 cells in various groups（n=3，±s）

表5 各組PC12細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3蛋白表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of Wnt1,β-catenin,GSK-3β,p-GSK-3β,and caspase 3 proteins in PC12 cells in various groups（n=3，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs MPTP group；#P＜0.05 vs MPTP+lidocaine group；○P＜0.05 vs MPTP+lidocaine+DKK1 group.

Group Control MPTP MPTP+lidocaine MPTP+lidocaine+DKK 1 MPTP+DKK 1 F P caspase 3 0.544±0.006 0.580±0.010*0.288±0.003*△0.351±0.021*△#0.705±0.015*△#○209.5＜0.01 Wnt1 0.961±0.008 0.563±0.011*0.609±0.011*△0.399±0.008*△#0.427±0.095*△#690.2＜0.01 β-catenin 0.975±0.005 0.408±0.004*0.476±0.010*△0.340±0.010*△#0.490±0.010*△#2 325＜0.01 GSK-3β 0.517±0.004 0.568±0.008*0.503±0.004*△0.729±0.010*△#0.721±0.005*△#342.5＜0.01 p-GSK-3β 0.545±0.005 0.772±0.014*0.419±0.004*△0.519±0.005△#0.575±0.015*△#190.6＜0.01

圖6 Western blotting法檢測(cè)各組PC12細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3蛋白表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of Wnt1,β-catenin,GSK-3β,p-GSK-3β,and caspase 3 proteins in PC12 cells in various groups detected by Western blotting method

圖7 各組PC12細(xì)胞中Wnt1、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和caspase 3蛋白表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of Wnt1，β-catenin，GSK-3β，p-GSK-3β，and caspase 3 proteins in PC12 cells in various groups

3 討 論

PD為排名第二位神經(jīng)退行性（neurodegenerative diseases，ND）疾病，60歲以上人口中約1%患該疾病［14］。盡管多巴胺能替代療法已經(jīng)可以大大改善PD患者的臨床癥狀，但對(duì)于其具體的發(fā)病機(jī)制了解仍然有限［15］。PD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床多以對(duì)癥治療為主，尚無相應(yīng)藥物可以阻止PD的進(jìn)展，因此對(duì)于這種ND患者的圍手術(shù)期神經(jīng)保護(hù)顯得尤為重要。本研究通過PD體外細(xì)胞模型尋找PD的發(fā)病機(jī)制，并且探討麻醉劑利多卡因是否通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路在PD模型中對(duì)PC12細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，為PD的治療提供理論依據(jù)。

氧化應(yīng)激在PD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。ROS在細(xì)胞中積聚，使抗氧化酶的活性降低，由于其他活化氧化酶失去平衡，可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的細(xì)胞發(fā)生功能障礙和細(xì)胞凋亡［16-18］。目前，神經(jīng)毒素MPTP的活性成分MPP+被廣泛應(yīng)用于PD體內(nèi)體外模型［19］。本研究結(jié)果表明：經(jīng)MPTP誘導(dǎo)的PD模型PC12細(xì)胞中ROS水平明顯高于對(duì)照組，此結(jié)果與前人研究［20-21］一致，說明MPTP可使PC12細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。加入利多卡因后，PC12細(xì)胞中ROS水平明顯降低，再加入Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑DKK 1后，ROS水平又升高，表明利多卡因可以降低細(xì)胞中MPTP帶來的氧化損傷，并且可能是通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，從而達(dá)到一定的保護(hù)作用。

研究［22］顯示：Wnt/β-catenin信號(hào)通路在炎癥疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均起重要作用，特別是在細(xì)胞凋亡存活過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。利多卡因也被證實(shí)可以抑制巨噬細(xì)胞中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的分泌，并在小鼠模型中發(fā)揮抗炎作用［23-24］。本研究結(jié)果顯示：利多卡因可抑制PC12細(xì)胞中IL-1β、IL-6及TNF-α的釋放，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。加入DKK1后，細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α釋放及caspase 3表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡增多，提示利多卡因可能是通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用。

有研究［25］顯示：Wnt/β-catenin信號(hào)通路啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在整個(gè)生命過程中正常的胚胎發(fā)育和幾乎所有組織和器官系統(tǒng)中均至關(guān)重要。研究［26-29］顯示：在PD模型中發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)生異常，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路障礙很有可能是PD發(fā)病機(jī)制之一。而GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在多種疾病的病理生理過程中起重要作用。本研究采用RT-qPCR法和Western blotting法進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果顯示：MPTP可明顯降低PD模型中Wnt和β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平，上調(diào)GSK-3β和p-GSK-3β的表達(dá)；而給予利多卡因治療后結(jié)果相反，在同時(shí)給予抑制劑DKK 1后，結(jié)果再次發(fā)生逆轉(zhuǎn)；上述結(jié)果提示利多卡因可以在MPTP誘導(dǎo)的PD模型PC12細(xì)胞中激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述，利多卡因?qū)PTP誘導(dǎo)的PD模型PC12細(xì)胞有一定保護(hù)作用，可顯著降低細(xì)胞中ROS的生成及抑制促炎性細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)還可顯著下調(diào)凋亡蛋白caspase 3的表達(dá)，其作用機(jī)制可能是通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用。本研究為利多卡因?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，未來應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究探討利多卡因的保護(hù)作用，為PD的治療提供新方案。