潘 潔,汪德州,宋文植

（1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？谇唤萄惺?，吉林 長(zhǎng)春 130031；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院口腔科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

在口腔臨床工作中，常因?yàn)槟[瘤、外傷和感染等原因造成口腔頜面部的骨質(zhì)缺損，而充足的骨量有利于提高口腔各類修復(fù)的穩(wěn)定性和長(zhǎng)期保存率；如口腔種植術(shù)過(guò)程中，為了確保種植體的成活率，口腔局部必須有足夠的骨量支撐［1-3］。目前臨床上針對(duì)這一情況普遍采取的是牙槽骨骨增量技術(shù)，該技術(shù)增加了種植術(shù)前種植區(qū)域的骨量，彌補(bǔ)了骨缺損［4］，在各類牙槽骨增骨材料中，Bio-Oss顆粒具有生物相容性好和可促進(jìn)血管再生且來(lái)源廣等優(yōu)點(diǎn)，在臨床中應(yīng)用廣泛，但該材料在生物體內(nèi)降解緩慢，有研究［5］顯示：Bio-OSS顆粒需要長(zhǎng)達(dá)3～5年才能完全降解，并且價(jià)格昂貴，骨粉的異源性可能帶來(lái)排異反應(yīng)，因此存在較多爭(zhēng)議，故而應(yīng)尋找到一些既具有良好的生物活性又有較好力學(xué)性能的無(wú)機(jī)化合物或高分子化合物，以豐富骨缺損修復(fù)材料的選擇［6］。

BOHNER［7］發(fā)現(xiàn)：將聚乳酸（polylactic acid，PLA）與聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）聚合而成的聚丙交酯-乙交酯［poly（lactide-co-glycolic acid），PLGA］聚合體，能夠通過(guò)改變單體之間的比例來(lái)控制降解從而得到優(yōu)異性能，但是純PLGA材料存在一定缺點(diǎn)，如骨傳導(dǎo)性差、機(jī)械性能欠佳和缺乏細(xì)胞識(shí)別等［8］，有學(xué)者［9］采用各種方法提升純PLGA材料的性能，如將PLGA/納米羥基磷灰石（nano-hydroxyapatite，n-HA）通過(guò)選擇性激光燒結(jié)的方法制備成三維復(fù)合多孔支架，支架結(jié)構(gòu)中加入n-HA，改善了聚合多孔支架的力學(xué)性能。GAO等［10］在細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)：將骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）同時(shí)固定于PLGA/羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）和純PLGA中，摻入HA能促進(jìn)細(xì)胞骨分化，上述研究或僅局限于體外細(xì)胞研究，或所制備的支架體積較大，無(wú)法應(yīng)用于修復(fù)口腔頜面骨缺損。頜骨具有特殊的解剖結(jié)構(gòu)，頜骨缺損形態(tài)不規(guī)則，將微球運(yùn)用于頜骨缺損逐漸成為一種趨勢(shì)。因此本實(shí)驗(yàn)將無(wú)機(jī)生物材料nHA與有機(jī)高分子材料PLGA混合后，采用氣流剪切法制備成形態(tài)均一的nHA/PLGA納米復(fù)合微球，置入制備好的大鼠顱骨缺損處，觀察nHA/PLGA納米復(fù)合微球?qū)︼B骨缺損的修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器8周齡SPF級(jí)雌性SD大鼠9只，購(gòu)自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2016-0001。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。PLGA（丙交酯/乙交酯=75∶25，相對(duì)分子質(zhì)量為100 000，由中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所提供），硝酸鈣（北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司），青霉素鈉（華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司），乙二醇（北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司），4%多聚甲醛固定液［阿拉丁試劑（上海）有限公司］，Bio-Oss顆粒［蓋思特利商貿(mào)（北京）有限公司］。慢速手機(jī)（韓國(guó)Strong90公司），電子天平（中國(guó)上海越平科學(xué)儀器制造有限公司），Skyscan1172微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro computed tomography，micro-CT）設(shè) 備（德國(guó)Bruker公司），Discovery CT 750 HD CT（美國(guó)GE公司）。

1.2 nHA/PLGA納米復(fù)合微球制備、模型制備和動(dòng)物分組將硝酸鈣溶于含10%乙二醇的水溶液中，通過(guò)水熱合成法合成nHA納米粒子，采用70℃烘箱干燥，合成nHA粉體，然后將nHA粉體加入8%PLGA/NMP溶液中，最后通過(guò)氣流剪切法裝置（噴嘴內(nèi)徑30 G、氣流強(qiáng)度8 L·min－1）制備出球形度和均一性較好的直徑為200～350μm的nHA/PLGA納米復(fù)合微球。選取9只SPF級(jí)雌性SD大鼠，禁食、禁水后采用50 mg·kg－1戊巴比妥麻醉，起效后術(shù)區(qū)備皮固定于手術(shù)臺(tái)上。1%碘伏術(shù)區(qū)消毒，75%乙醇脫碘，鋪孔巾，采用手術(shù)刀由額部至頸前做1個(gè)矢狀切口抵達(dá)骨面，鈍性分離充分暴露手術(shù)區(qū)域。慢速手機(jī)在生理鹽水滴注降溫的情況下，沿大鼠顱骨矢狀縫對(duì)稱磨出2個(gè)直徑為5 mm深達(dá)硬膜上的缺損［11］。在9只大鼠顱骨上制備18個(gè)骨缺損模型后，隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6個(gè)骨模型，空白組大鼠僅制備顱骨缺損而未填充材料，對(duì)照組大鼠于顱骨缺損處植入Bio-Oss顆粒，實(shí)驗(yàn)組大鼠于顱骨缺損處植入nHA/PLGA納米復(fù)合微球。黏骨膜瓣復(fù)位分層嚴(yán)密縫合，術(shù)后肌注20萬(wàn)單位青霉素鈉1周抗炎，常規(guī)飲食。

1.3 micro-CT檢測(cè)各組大鼠實(shí)驗(yàn)標(biāo)本缺損區(qū)域骨形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)嚴(yán)密觀察大鼠術(shù)區(qū)情況，并于全麻下在術(shù)后當(dāng)天、第4周和第8周，對(duì)各組大鼠行活體CT檢測(cè)，觀察大鼠術(shù)區(qū)有無(wú)骨質(zhì)的改變。第8周時(shí)采用150 mg·kg－1戊巴比妥麻醉處死大鼠，先將被PBS灌注后的大鼠標(biāo)本置入4%多聚甲醛溶液中固定備用，采用micro-CT對(duì)標(biāo)本頭部損害區(qū)域掃描，最后采用三維重建軟件對(duì)缺損處圖像進(jìn)行處理，檢測(cè)各組大鼠顱骨缺損區(qū)域骨小梁數(shù)量（number of trabecular bone，Tb.N）、缺損區(qū)域骨小梁間距（trabecular bone spacing，Tb.Sp）、缺損區(qū)域骨小梁厚度（trabecular bone thickness，Tb.Th）和缺損區(qū)域新生骨量與缺損總體積的比值（new bone volume/total bone volume，BV/TV）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠顱骨缺損區(qū)域Tb.N、缺損區(qū)域Tb.Sp、缺損區(qū)域Tb.Th和缺損區(qū)域BV/TV均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠顱骨缺損面積和新骨形成情況術(shù)后當(dāng)天的CT三維重建結(jié)果顯示：大鼠顱骨缺損模型與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)接近，預(yù)備的缺損直徑均接近5 mm。在第4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠顱骨缺損面積均有所減小，而空白組大鼠顱骨無(wú)明顯變化。當(dāng)飼養(yǎng)至第8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠顱骨缺損面積較第4周時(shí)均有明顯減小，空白組修復(fù)效果則不明顯。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組大鼠于術(shù)后當(dāng)天、術(shù)后4周和術(shù)后8周的顱骨CT三維重建見(jiàn)圖1。

圖1 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠顱骨CT三維重建圖像Fig.1 Images of CT three-dimensional reconstruction of skull of rats in various groups at different time points after surgery

與對(duì)照組相似，在飼養(yǎng)至第8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠顱骨出現(xiàn)了明顯的新骨形成，表明nHA/PLGA納米復(fù)合微球與商品化Bio-Oss顆粒有相似的促成骨能力。

2.2 各組大鼠三維重建后骨缺損處micro-CT圖像9只SPF級(jí)雌性SD大鼠全部存活，傷口未見(jiàn)排斥反應(yīng)和感染，故全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果納入分析。術(shù)后8周可見(jiàn)大鼠顱骨手術(shù)區(qū)域黏膜愈合良好，無(wú)化膿和感染等情況發(fā)生，沿原手術(shù)切口切開(kāi)翻瓣觀察。實(shí)驗(yàn)組大鼠顱骨：缺損區(qū)域邊界清晰，充填材料被纖維結(jié)締組織包繞，顆粒間隙內(nèi)可見(jiàn)新生骨質(zhì)；對(duì)照組大鼠顱骨：缺損區(qū)域見(jiàn)顆粒狀骨粉堆積，質(zhì)地堅(jiān)硬，無(wú)明顯吸收，表面被覆纖維結(jié)締組織；空白組大鼠顱骨：缺損區(qū)域邊界清晰可見(jiàn)少量新骨形成，但缺損中心區(qū)域有明顯凹陷無(wú)明顯骨沉積。micro-CT掃描大鼠顱骨標(biāo)本后，三維軟件重建圖像見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠骨缺損處三維重建后micro-CT圖像Fig.2 Micro-CT images of bone defects of rats in various groups after three-dimensional reconstruction

2.3 各組大鼠顱骨標(biāo)本缺損區(qū)域骨形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)第8周，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠顱骨缺損區(qū)域Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），BV/TV降低（P＜0.05）；與空白組比較，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠顱骨缺損區(qū)域Tb.Sp、Tb.Th和BV/TV差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠缺損區(qū)域骨形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)Tab.1 Data of bone morphology of defect regions of rats in various groups (n=6，±s）

表1 各組大鼠缺損區(qū)域骨形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)Tab.1 Data of bone morphology of defect regions of rats in various groups (n=6，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with blank group.

Group Blank Control Experimental Tb.N（mm－1）3.613±0.300 3.890±0.200 3.768±0.200 BV/TV（η/%）28.007±4.820 81.286±4.330△72.034±5.200*△Tb.Sp（l/mm）0.187±0.020 0.058±0.020△0.068±0.020△T b.Th（l/mm）0.078±0.010 0.210±0.010△0.191±0.010△

3 討 論

對(duì)于口腔常規(guī)牙列缺損和牙列缺失的患者，目前臨床最好的修復(fù)方式是種植修復(fù)，但部分患者由于各種原因?qū)е戮植咳毖绤^(qū)骨量不足，骨質(zhì)疏松骨密度降低，。而骨密度的高低直接影響種植體的初期穩(wěn)定性，影響種植手術(shù)的成功率［12-14］。充足的骨量也是種植成骨率和長(zhǎng)期存活率的保障［15］。

目前臨床上對(duì)于種植區(qū)域骨量不足，主要采用骨替代材料移植填充缺損和骨組織工程這2種方法，其中充填材料效果最佳的是自體骨，是臨床的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其存在植入后吸收率高（有時(shí)高達(dá)50%）和二次創(chuàng)傷等缺點(diǎn)［12-16］。自體骨來(lái)源有限，同種異體骨來(lái)源豐富且能個(gè)性化地修復(fù)骨缺損［17-18］，但移植后存在排斥反應(yīng)且有傳播疾病的可能性［19］，因此近幾年骨組織工程發(fā)展迅速，致力于研究出成分、結(jié)構(gòu)和生物特性與天然骨相似的人工材料，以彌補(bǔ)現(xiàn)有材料的不足。

Bio-Oss顆粒是臨床上應(yīng)用最為廣泛的骨增量材料，其內(nèi)部含有大小不一的孔隙，使材料內(nèi)部表面積增大，并且此材料不含有機(jī)成分，親水能力強(qiáng)，使得缺損區(qū)域血液和組織液快速融入材料中，保持植骨區(qū)的相對(duì)穩(wěn)定性，有利于新骨的再生和血管的生長(zhǎng)［20-22］。研究［23］顯示：Bio-Oss顆粒的成骨效果優(yōu)于其他骨增量材料，可以更早地與缺損區(qū)域周圍骨組織產(chǎn)生骨融合，但該材料的缺點(diǎn)也同樣明顯，該材料在生物體內(nèi)不易吸收且降解緩慢。

本研究將無(wú)機(jī)生物材料nHA與有機(jī)高分子材料PLGA混合后，通過(guò)氣流剪切法制備成形態(tài)均一的nHA/PLGA納米復(fù)合微球，HA是牙槽骨的主要成分，故合成的nHA是最接近天然骨組織的材料。與HA比較，nHA具有更好的生物活性和更強(qiáng)的吸附性［24-25］。PLGA是一種具有很好組織相容性和可降解性的聚合物，是理想的支架和載體材料［26］，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。將這2種材料合成nHA/PLGA納米復(fù)合微球，兼顧理想材料的多個(gè)特性，如良好的生物相容性、對(duì)組織無(wú)毒或者毒性低、吸附能力強(qiáng)和降解速率可控等［27］。研究［28］顯示：不同濃度的nHA復(fù)合微球產(chǎn)生的成骨效果不同，nHA含量為20%的復(fù)合微球，能達(dá)到最佳修復(fù)骨缺損的效果。

本研究結(jié)果顯示：將20%nHA/PLGA納米復(fù)合微球和Bio-Oss顆粒分別植入大鼠顱骨中，在術(shù)后當(dāng)天、術(shù)后4周及術(shù)后8周的顱骨CT三維重建中可見(jiàn)：nHA/PLGA納米復(fù)合微球與商品化Bio-Oss顆粒有相似的促成骨能力，術(shù)后8周處死大鼠顯示大鼠局部皮膚并未出現(xiàn)紅腫破潰等排斥反應(yīng)，填入nHA/PLGA納米復(fù)合微球大鼠顱骨中可見(jiàn)充填材料被纖維結(jié)締組織包繞，顆粒間隙內(nèi)可見(jiàn)新生骨質(zhì)，填入Bio-Oss顆粒大鼠顱骨中可見(jiàn)纖維結(jié)締組織包繞著未明顯吸收顆粒狀骨粉，有新生骨質(zhì)形成，而這一表現(xiàn)也與XIA等［29］的研究結(jié)論具有相似性。術(shù)后第8周對(duì)大鼠顱骨標(biāo)本進(jìn)行micro-CT掃描，三維軟件重建圖像的結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組大鼠顱骨缺損區(qū)域Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但實(shí)驗(yàn)組大鼠顱骨缺損區(qū)域BV/TV略低于對(duì)照組，Bio-Oss顆粒作為低替代率骨材料，目前廣泛化應(yīng)用于臨床，已獲得公認(rèn)的臨床效果，但其低替代率決定了植骨后長(zhǎng)期無(wú)法降解［29-30］，這與本研究結(jié)果相符，對(duì)照組大鼠8周內(nèi)降解有限，顱骨缺損區(qū)域中的新生骨量有限，顱骨缺損區(qū)域大部分仍由Bio-Oss顆粒填充，而通過(guò)micro-CT三維重建可以發(fā)現(xiàn)：植入nHA/PLGA的實(shí)驗(yàn)組大鼠顱骨缺損區(qū)域中可見(jiàn)明顯的新骨形成。理想的人工骨修復(fù)材料需要具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性，在植入骨缺損區(qū)域后能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖分化，形成新骨，從而取得與自體骨移植類似的骨修復(fù)效果。與Bio-Oss顆粒比較，nHA/PLGA納米復(fù)合微球具有更好的降解性和骨誘導(dǎo)性，在微球降解的同時(shí)可以誘導(dǎo)新骨的形成。

綜上所述，20%nHA/PLGA納米復(fù)合微球在植入骨缺損后獲得了理想的骨修復(fù)效果，與商品化Bio-Oss顆粒比較，20%nHA/PLGA納米復(fù)合微球生物相容性更好，可在體內(nèi)降解并誘導(dǎo)新骨形成，因此較低替代率的Bio-Oss顆粒具有更好的臨床應(yīng)用前景。