孫士瑩,孫 戈,林 琳,趙 越

（1.中國醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 教育部醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)重點實驗室，遼寧 沈陽 110122；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 合肥 230601）

在哺乳動物的睪丸和附睪中，精原細胞產(chǎn)生成熟的精子，這一過程受到精小管中包括睪丸間質(zhì)細胞和睪丸支持細胞在內(nèi)的一系列細胞和其中分子相互作用的精確調(diào)控，揭示睪丸細胞中關(guān)鍵分子機制具有重要意義［1］。雄激素在體內(nèi)主要活性形式包括睪 酮 （testosterone， T） 和 雙 氫 睪 酮（dihydrotestosterone，DHT），是 雄 激 素 受 體（androgen receptor，AR）的主要配體。AR作為性激素受體超家族成員之一，通常在體內(nèi)被雄激素激活，特別是在人類精子發(fā)生過程中調(diào)控大量的AR靶基因的激活［2-4］。本課題組前期研究［5］顯示：溴區(qū)PHD結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（bromodomin PHD domain transcription factor，BPTF）相 關(guān) 蛋 白18（BPTF associated protein 18，BAP18）是一個功能未知的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為18 000，可以在具有AR轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的果蠅體內(nèi)上調(diào)AR的轉(zhuǎn)錄活性，并促進男性前列腺癌和去勢型前列腺癌的腫瘤進程。BAP18在其蛋白氮端含有1個SANT結(jié)構(gòu)域，因此被認為可以與其他染色質(zhì)重塑蛋白共同廣泛地參與染色質(zhì)重塑過程和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。然而，關(guān)于BAP18和AR在睪丸細胞中如何發(fā)揮作用目前尚未見相關(guān)文獻報道。本研究探討B(tài)AP18對AR介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，旨在為雄性睪丸細胞異常的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器R2C和15P-1、TM 3、TM 4和22Rv1細胞由中國醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院染色質(zhì)生物研究室保存，其中R2C和TM 3為大鼠睪丸間質(zhì)細胞，TM 4和15P-1為大鼠睪丸支持細胞，22Rv1為人前列腺癌細胞（作為對照）。DMEM高糖培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基購自美國Thermo Scientific公司，胎牛/馬血清購自美國BI公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）相關(guān)試劑購自日本TaKaRa公司，BAP18和AR等相關(guān)抗體購自美國CST公司，Western blotting相關(guān)試劑購自上海碧云天生物科技有限公司，T和DHT購自美國Sigma公司（T 5411和D073）。蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，PCR擴增儀購自美國ABI公司，全自動酶標儀購自法國巴德斯公司。

1.2 細胞培養(yǎng)本實驗所采用R2C細胞采用含2.5%胎牛血清和15%馬血清的混合血清及1%青霉素/鏈霉素雙抗的Ham’s F12培養(yǎng)基，15P-1和22Rv1細胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。TM 3和TM 4細胞則采用含5%馬血清/2.5%胎牛血清混合血清的F12/DMEM 1∶1混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細胞均置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建BAP18質(zhì)粒構(gòu)建于帶有FLAG標簽的PcDNA 3質(zhì)粒中［5］。

1.4 RT-qPCR法檢測細胞中目的基因mRNA表達水平總RNA采用TRIzol進行分離。采用PrimeScriptTMRT-qPCR試劑盒對總RNA（2μg）進行逆轉(zhuǎn)錄。實時聚合酶鏈反應(yīng)采用SYBR預(yù)混Ex Taq試劑盒在Mx3000P儀器（Agilent StrataGene）上進行。正向和反向引物如下：BAP18 F 5′-ACCCAAGAAGATGACGTCCG-3′，BAP18 R 5-′CACAGAAGTCAAAGGGCGAG-3′；AR F 5′-TTCCCAAAGAAGCCGACAGT-3′，AR R 5′-CCAGTCACAAAGCTCCGCTA-3′；STAR F 5′-CTGCAGGACTCAGGACCTTG-3′，STAR R 5′-ACACAGCTTGAACGTAGCGA-3′；HSD3B1 F 5′-GTTTGTGGGCCAGAGGATCA-3′，HSD3B1 R 5′-TAGGATGGTCTGCCTGGG-AA-3′；CYP17A 1 F 5′-TGGAGGCCACTATCC-GAGAA-3′， CYP17A 1 R 5′-CATGGGATCCGGGACGTTAG-3′；DDX25 F 5′-TCTCGTCCATCCCAGGAAGA-3′，DDX25 R 5′-AGTGGAGAGCTGGGATCCTT-3′。以GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果代表至少3次的獨立實驗結(jié)果。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60 s，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40個循環(huán)。以U 6或GAPDH作為內(nèi)參，采用2－△△Ct法 計算細胞中目的基因mRNA表達水平。

1.5 Western blotting法檢測細胞中目的蛋白表達水平收集細胞，提取細胞總蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白質(zhì)的濃度，取35μg蛋白質(zhì)經(jīng)10%SDSPAGE分離，210 mA恒流下進行濕轉(zhuǎn)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉2 h后加入一抗，在4℃孵育過夜，第2天采用TBST洗去游離抗體，加入HRP標記的山羊抗小鼠或兔IgG二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光液顯色。顯色結(jié)果采用Image Lab軟件分析灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.6 蛋白質(zhì)免疫共沉淀（proteinimmunoprecipitation，co-IP）法檢測蛋白與蛋白的相互作用細胞全提取液采用特定的抗體4℃過夜持續(xù)孵育。第2天，采用protein G磁珠繼續(xù)孵育2～4 h。磁珠在孵育后離心分離，然后采用冰PBS洗滌3次，最后采用20～30μL SDS-loading煮沸后行Western blotting實驗。

1.7 熒光素酶雙基因報告實驗檢測細胞中熒光素酶活性采用AR（20 ng）、腎素?zé)晒馑孛纲|(zhì)粒（pRL）（2 ng）和BAP18質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染R2C細胞，細胞轉(zhuǎn)染嚴格按照jetPrime轉(zhuǎn)染試劑的說明進行。轉(zhuǎn)染后4 h，細胞換液培養(yǎng)于無血清DMEM培養(yǎng)基中，并添加乙醇或10－8mol·L－1T或DHT。24 h后收集細胞，并采用前期研究［6］所述的熒光素酶雙基因報告實驗檢測系統(tǒng)檢測細胞中熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。睪丸細胞中AR和BAP18 mRNA和蛋白表達水平，細胞中熒光素酶活性，BAP18過表達后細胞中BAP18、AR、STAR、HSD3B1、CYP17A 1和DDX25 mRNA表達水平及CYP17A 1蛋白表達水平符合正態(tài)分布，以±s表示，組間比較采用Student’st檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠睪丸細胞中AR和BAP18 mRNA和蛋白表達水平RT-qPCR檢測結(jié)果顯示：睪丸細胞R2C和15P-1細胞中BAP18 mRNA表達水平低于15P-1細胞。Western blotting法檢測大鼠睪丸細胞中AR和BAP18蛋白表達的結(jié)果顯示：AR主要在睪丸R2C細胞中高表達，在其他細胞中表達水平較低，其他各類細胞中，22Rv1細胞中BAP18蛋白表達水平最高。見圖1和2。

圖1 睪丸細胞中AR和BAP18 mRNA和蛋白表達水平Fig.1 Expression levels of AR and BAP18 m RNA and protein in testicular cells

2.2 細胞中熒光素酶活性在R2C細胞中BAP18可以與野生型AR相互作用（圖3）。熒光素酶雙基因報告實驗結(jié)果顯示：在R2C細胞中同時外源轉(zhuǎn)染定量BAP18表達質(zhì)粒后，在DHT的作用下，細胞中熒光素酶活性升高近3倍，而在T的作用下，細胞中熒光素酶活性升高1.5倍（圖4）。

圖2 Western blotting法檢測睪丸細胞中AR和BAP18蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of AR and BAP18 proteins in testicular cells detected by Western blotting method

圖3 R2C細胞中BAP18與AR的相互作用Fig.3 Interaction of BAP18 and AR in R2C cells

圖4 DHT（A）和T（B）作用后BAP18過表達組細胞中熒光素酶活性Fig.4 Luciferaseactivitiesin cellsin BAP18over-expression group after treated with DHT(A)and T(B)

2.3 BAP18過表達前后細胞中相關(guān)基因mRNA表達水平R2C細胞中過表達BAP18后，經(jīng)溶解DHT的溶劑EtOH、T和DHT作用后，細胞中AR、STAR、HSD3B1和DDX25 mRNA表達水平與BAP18過表達前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而CYP17A 1 mRNA表達水平高于BAP18過表達前（P＜0.05）；T和DHT作用后，細胞中CYP17A 1 mRNA表達水平均高于T和DHT作用前（P＜0.05）。見表1。

表1 BAP18過表達前后R2C細胞中BAP18、AR、STAR、HSD3B1、CYP17A1和DDX25 mRNA水平Tab.1 Expression levels of BAP18,AR,STAR,HSD3B1,CYP17A1,and DDX25 mRNA in R2C cells before and after over-expression of BAP18 （n=3，x±s）

2.4 BAP18過表達前后細胞中相關(guān)蛋白表達水平R2C細胞中過表達BAP18后，T和DHT作用后CYP17A 1蛋白表達水平明顯高于T和DHT作用前（P＜0.05），但T和DHT作用前后細胞中DDX25蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 BAP18過表達前后細胞中CYP17A 1蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expression of CYP17A 1 protein in cells before and after BAP18 overexpression

3 討 論

AR信號通路在精子發(fā)生和成熟過程中起重要作用［7-8］。雖然人們對AR輔調(diào)節(jié)因子在睪丸中的作用已經(jīng)有了一定的了解，但關(guān)于睪丸間質(zhì)細胞中AR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄分子機制尚不清楚，睪丸中通過AR信號通路調(diào)節(jié)間質(zhì)細胞生物學(xué)功能的確切機制尚不清楚［4，9］。本研究中結(jié)果顯示：BAP18可以在多種睪丸細胞中表達，其中包括睪丸間質(zhì)細胞和睪丸支持細胞R2C和TM 3及睪丸間質(zhì)細胞TM 4和15P-1。BAP18作為在睪丸間質(zhì)細胞中全新的AR輔調(diào)節(jié)因子可以與AR相互作用并上調(diào)AR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。BAP18可以在睪酮和DHT的作用下特異性調(diào)控CYP17A 1的表達，提示BAP18在睪丸細胞生理過程中可能起重要作用。

AR目前是雄激素在睪丸中的唯一受體，且在不同的細胞中發(fā)揮時空特異性作用［10-11］。盡管精子的生存和成熟需要雄激素且成熟的精子中并不表達AR，但成熟睪丸中支持細胞、間質(zhì)細胞、管周肌樣細胞、血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞均表達雄激 素 受 體［12-13］。研 究［14-17］顯 示：成 人 的 睪 丸 間 質(zhì)細胞中有穩(wěn)定的AR表達，且AR隨睪丸發(fā)育成熟度和不同細胞功能周期性表達。與AR相關(guān)的周期性表達蛋白有潛在的調(diào)節(jié)睪丸生理功能的作用［7，12］。本研究結(jié)果顯示：AR主要在大鼠睪丸間質(zhì)細胞R2C細胞中表達，在其他3種大鼠睪丸細胞中表達量極低，而BAP18在4種大鼠睪丸細胞種均有表達。提示BAP18可能不止在睪丸間質(zhì)細胞中發(fā)揮作用，而在睪丸支持細胞中也有可能發(fā)揮獨立于AR的其他作用。

在睪丸組織中，T是調(diào)控精子發(fā)生過程中最主要的雄激素［7，18-19］。研究［20-21］顯示：睪丸組織中T是由睪丸間質(zhì)細胞對促黃體激素（luteinizing hormone，LH）反應(yīng)而產(chǎn)生，繼而由旁分泌通路分散至生精小管中的睪丸支持細胞中，與AR相互作用調(diào)控生精生理過程。睪丸間質(zhì)細胞中雄激素信號通路被廣泛認為在精子發(fā)生過程包括CYP17A 1、HSD17B3、HSD3B6、STAR、DDX25、RLF、LHR和TSP-2等類固醇酶的表達至關(guān)重要［15，22］。本研究結(jié)果顯示：BAP18可以通過AR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄顯著影響CYP17A 1 mRNA和蛋白表達水平。過表達BAP18在無T或DHT作用下，CYP17A 1 mRNA和蛋白的表達水平仍可以升高。若BAP18表達水平存在變化，睪丸間質(zhì)細胞的T合成通路有可能受到嚴重影響，最終可能會導(dǎo)致精子發(fā)生和成熟障礙。BAP18在睪丸精子發(fā)生和男性精子成熟障礙癥的治療過程中可能發(fā)揮重要作用。