陳銀卿，黎梓城，童 星，陳 杰，葛丹陽(yáng)，彭綺珊，李 丹，胡長(zhǎng)鷹*

（1.暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.廣州海關(guān)技術(shù)中心 國(guó)家食品接觸材料檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣東），廣東 廣州 510623；3.暨南大學(xué) 包裝工程學(xué)院，廣東省普通高校產(chǎn)品包裝與物流重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 珠海 519070）

牧場(chǎng)擠奶環(huán)節(jié)是乳制品生產(chǎn)鏈的第一個(gè)環(huán)節(jié)，而食品接觸用橡膠奶襯是擠奶環(huán)節(jié)所需的部件，奶襯既直接接觸奶牛乳頭又直接接觸原料乳，因此奶襯的安全性值得關(guān)注。奶襯通常由丁腈橡膠或丁腈橡膠和天然橡膠混合制成，其使用壽命為2 500擠奶頭次或4 ～6個(gè)月［1-2］。因此，對(duì)于奶襯的彈性及防老化性能要求較高。為提高橡膠奶襯的性能，一般在其生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)加入各種橡膠助劑，如硫化劑、填充劑、抗氧化劑、增塑劑和防老劑等［3-7］。

在擠奶過(guò)程中，奶襯與原料乳直接接觸時(shí)材料中的有害物質(zhì)可能向原料乳遷移，這些物質(zhì)可能是奶襯加工過(guò)程中使用的添加劑；也可能是非有意添加物（NIAS），主要包括聚合物的降解產(chǎn)物、單體的殘留雜質(zhì)和副反應(yīng)產(chǎn)物等［8-9］。工業(yè)生產(chǎn)中常用的橡膠促進(jìn)劑有N-甲基苯胺（N-Methylaniline，NMA）［10-11］、二苯胍（1，3-Diphenylguanidine，DPG）［12］和2-巰基苯并噻唑（2-Mercaptobenzothiazole，MBT）［5］。研究表明，N-甲基苯胺是致癌物N-亞硝胺的前體物［13］；苯胺（Aniline，ANI）［14］和苯并噻唑（Benzothiazole，BT）［15］分別由二苯胍和2-巰基苯并噻唑等噻唑類(lèi)硫化促進(jìn)劑在橡膠硫化過(guò)程中分解產(chǎn)生并殘留在橡膠材料中。因上述5種化合物具有一定的毒性、致癌性和生殖毒性［16-19］，歐盟ResAP（2004）4 決議［20］規(guī)定MBT的特定遷移限量（SML）為8 mg/kg；ANI 和NMA 為不得檢出，檢出限（即遷移限量）為0.01 mg/kg。德國(guó)聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所（BfR）針對(duì)橡膠制品制定的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估建議書(shū)［21-23］規(guī)定，MBT 和DPG 的SML 分別為2、60 mg/kg。目前，分別測(cè)定上述5 種化合物的方法主要有液相色譜法［14，24-27］和液相色譜-質(zhì)譜法［28-30］等，這些方法僅針對(duì)一種或一類(lèi)化合物，且存在檢出限偏高和檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等不足，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中以檢測(cè)DPG、MBT和BT的殘留量為主，而同時(shí)測(cè)定上述5種化合物遷移量的方法未見(jiàn)報(bào)道。

本研究應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定食品接觸用橡膠奶襯中苯胺、N-甲基苯胺、二苯胍、2-巰基苯并噻唑和苯并噻唑遷移量的方法。采用該方法對(duì)市售的10種奶襯進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，并依據(jù)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了合規(guī)性判定和安全性評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

從企業(yè)征集和市場(chǎng)采購(gòu)10種常用的食品接觸用橡膠奶襯制品（R1 ～R10）。

標(biāo)準(zhǔn)品：苯胺（純度＞99.73%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司）；二苯胍（純度＞98.8%，東莞元佳實(shí)驗(yàn)科技有限公司）；苯并噻唑、N-甲基苯胺、2-巰基苯并噻唑（純度＞99.0%，北京百靈威科技有限公司）。甲醇、乙醇、甲酸和乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher Chemical 公司）；NaOH、磷酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200-6460型高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Milli-Q超純水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）；AL204 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；UF110plus型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（德國(guó)Memmert公司）；針筒注射器（聚民生物科技有限公司）；尼龍濾膜（孔徑0.45 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；移液器（20 ～200 μL，100 ～1 000 μL，5 mL，德國(guó)Brand Transferpette公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理根據(jù)廠家提供的奶襯清洗信息，對(duì)每根奶襯在遷移實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行5步清洗：用溫度為35 ～46 ℃的500 mL自來(lái)水清洗樣品；用溫度為75 ～85 ℃的500 mL NaOH 溶液（pH 2 ～14）清洗樣品；用常溫的500 mL自來(lái)水清洗樣品；用溫度為35 ～46 ℃的500 mL磷酸溶液（pH 2 ～3）清洗樣品；最后用常溫的500 mL自來(lái)水清洗樣品。奶襯需在清洗后靜置晾干1 h再進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取5種標(biāo)準(zhǔn)品約0.01 g，以甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；用50%乙醇逐級(jí)稀釋得到5 種化合物質(zhì)量濃度分別為3、5、10、20、50、80、100、200、500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃冰箱冷藏，待測(cè)。

1.3.3 儀器工作條件色譜條件：色譜柱：Agilent Poroshell 120EC-C18（3 mm × 50 mm，2.7 μm）；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脫條件為：0 ～0.5 min，90% A；0.5 ～1.0 min，90% ～10% A；1.0 ～4.5 min，10% A；4.5 ～6.5 min，10%～90%A。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；干燥氣溫度290 ℃；干燥氣流速5 L/min；霧化氣壓力241 316.5 Pa（35 psi）；鞘氣溫度250 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細(xì)管電壓3 500 V。其他主要質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表1 5種化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 5 compounds

1.3.4 遷移實(shí)驗(yàn)按照歐盟ResAP（2004）4 決議［20］和GB 4806.11-2016［31］，重復(fù)進(jìn)行3 次遷移實(shí)驗(yàn)，且每次遷移實(shí)驗(yàn)均使用1份新的模擬物依次進(jìn)行，并以第3次遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行合規(guī)性判定；對(duì)于SML 為不得檢出的化合物，以第1 次遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行合規(guī)性判定。根據(jù)奶襯的預(yù)期用途和可預(yù)見(jiàn)的最嚴(yán)厲接觸條件（預(yù)期接觸溫度不超過(guò)37 ℃，一般擠奶時(shí)間為4 ～7 min［32］），以及各國(guó)關(guān)于奶襯的相關(guān)遷移實(shí)驗(yàn)條件規(guī)定，選擇50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液作為食品模擬物，遷移時(shí)間根據(jù)各國(guó)的規(guī)定分別是40 ℃10 min［21-23］、40 ℃30 min［20，31］和40 ℃120 min［33］。同時(shí)，對(duì)同一根奶襯進(jìn)行重復(fù)使用60次的實(shí)驗(yàn)來(lái)模擬使用3 d且每天重復(fù)使用20次的實(shí)際情況，每次的遷移條件為40 ℃10 min。

1.3.5 遷移量的計(jì)算遷移量按公式（1）計(jì)算。

式中：Mi為食品模擬物中5種化合物的特定遷移量（mg/kg）；c為遷移實(shí)驗(yàn)取樣點(diǎn)測(cè)得的化合物質(zhì)量濃度（μg/L）；c0為空白的質(zhì)量濃度（μg/L）；N為稀釋倍數(shù)；V為遷移實(shí)驗(yàn)浸泡液總體積（L）；S為奶襯與食品模擬物的接觸面積（dm2）；S0為奶襯實(shí)際接觸原料乳的面積（dm2）；m1為奶襯實(shí)際接觸原料乳的體積所對(duì)應(yīng)的原料乳質(zhì)量（kg），按密度為1 kg/L將其體積換算為相應(yīng)的質(zhì)量；1 000為單位換算。

1.4 安全評(píng)估

1.4.1 合規(guī)性評(píng)估方法在各國(guó)法規(guī)建立的被授權(quán)用于橡膠配方和制造的化合物肯定列表中查詢(xún)相應(yīng)化合物的管控規(guī)定，若有法規(guī)管控則將遷移量與法規(guī)管控的SML進(jìn)行比較，判斷是否合規(guī)。

1.4.2 安全性評(píng)估方法若化合物未出現(xiàn)在各國(guó)法規(guī)的肯定列表，使用毒理學(xué)關(guān)注閾值法（TTC）進(jìn)行安全評(píng)估［34-35］。利用Toxtree 軟件（v2.6.13）對(duì)化合物進(jìn)行Cramer 結(jié)構(gòu)分類(lèi)，Cramer Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的安全閾值分別為1.8、0.54、0.09 mg/（person·day）。根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對(duì)食品接觸材料的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法對(duì)其進(jìn)行安全評(píng)估。

式中：EDI（mg/（person·day））為化合物估算的每人每日攝入量；Ma（mg/kg）為奶襯中的化合物遷移到食品模擬物中的遷移量；m為每人每天的食物攝入量；CF指與特定包裝材料接觸的食品占食品總攝入量的百分?jǐn)?shù)，本文的CF值為1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件和Origin 2018軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

根據(jù)5種化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)5 種化合物的分離效果及靈敏度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水時(shí)，5種化合物的保留時(shí)間適中且峰形較好，因此選擇乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相。使用“1.3.3”的梯度洗脫條件可保證5種化合物有較好的保留時(shí)間和峰形，同時(shí)使其他不被關(guān)注的組分能及時(shí)流出色譜柱，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別考察了5種化合物在大氣壓化學(xué)電離源（APCI）和ESI源的正離子與負(fù)離子掃描模式下的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)ESI源的響應(yīng)更好，故采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。以0.1 mL/min流速注入0.5 mg/L的5 種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在ESI+、ESI-掃描模式下，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描確定母離子Q1；隨后，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描確定子離子，選取豐度最大的兩個(gè)離子作為子離子，其中豐度較大的作為定量離子，豐度相對(duì)較小的作為定性離子；最后，在MRM模式下對(duì)碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后5種化合物的MRM圖見(jiàn)圖1。

圖1 5種化合物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of 5 compounds

2.3 線性方程、檢出限及定量下限

按照“1.3.2”配制5種化合物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行檢測(cè)，以定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。以信噪比S/N≥3計(jì)算檢出限（LOD），以S/N≥10 計(jì)算定量下限（LOQ），結(jié)果如表2 所示。5 種化合物的定量離子峰面積與其質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均不小于0.996 6，檢出限和定量下限分別為0.8～20 μg/L和3～50 μg/L，均滿足檢測(cè)要求。

表2 5種化合物的線性參數(shù)、檢出限與定量下限Table 2 Linear parameters，detection limits and quantitation limits of 5 compounds

2.4 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)本方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，以食品模擬物（50%乙醇）為空白樣品，分別添加不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液并按照遷移條件（40 ℃120 min）進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。由表3 可知，5 種化合物在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為93.4%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為0.70%～4.3%，滿足定量分析方法的相關(guān)要求。

表3 5種化合物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（n=6）of 5 compounds standard solution

2.5 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照“1.3.4”條件進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，并采用建立的方法對(duì)10 種奶襯進(jìn)行測(cè)定。由圖2A可知，10個(gè)樣品中的ANI在3個(gè)遷移條件下均有檢出，且均高于遷移限量（0.01 mg/kg），最大遷移值在40 ℃120 min遷移條件下，達(dá)0.34 mg/kg；由圖2B可知，8個(gè)樣品中的NMA在3個(gè)遷移條件下均超標(biāo)，在40 ℃120 min遷移條件下達(dá)0.03 ～2.18 mg/kg，而僅有R4 和R10 未檢出。根據(jù)相關(guān)法規(guī)要求，ANI 和NMA 的檢出對(duì)人體存在健康風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)引起高度關(guān)注，有必要改進(jìn)配方或工藝來(lái)控制ANI和NMA的生成。

圖2 橡膠奶襯（R1 ～R10）中苯胺和N-甲基苯胺向50%乙醇中的遷移量Fig.2 Migration amounts of ANI and NMA from rubber liners（R1-R10）to 50%ethanol

對(duì)于有SML規(guī)定的DPG 和MBT 則根據(jù)第3次遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)評(píng)判（圖3）。由圖3A 可知，DPG 僅在R1中檢出，且在3個(gè)遷移條件下均未超標(biāo)?？赡苁悄桃r生產(chǎn)企業(yè)在配方設(shè)計(jì)時(shí)對(duì)該類(lèi)物質(zhì)的使用量較低。由圖3B 可知，MBT 在40 ℃10 min遷移條件下均未超過(guò)2 mg/kg 的限值；MBT 向50%乙醇的遷移量隨著遷移時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在40 ℃30 min 和40 ℃120 min 遷移條件下10 個(gè)樣品的遷移量均未超過(guò)8 mg/kg的限值。由此可見(jiàn)，MBT在合成橡膠材料及其制品中普遍使用，雖有檢出，但遠(yuǎn)小于法規(guī)的限量要求。

圖3 橡膠奶襯（R1 ～R10）中二苯胍和2-巰基苯并噻唑向50%乙醇中的遷移量Fig.3 Migration amounts of DPG and MBT from rubber liners（R1-R10）to 50%ethanol

BT 向50%乙醇的遷移量隨著遷移時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（圖4）。奶襯預(yù)期接觸的食品是原料奶，根據(jù)中國(guó)居民膳食指南（2016）［36］，推薦人均每日奶類(lèi)食物的攝入量為0.30 kg。由式（2），上述10 種奶襯中BT 遷移到50%乙醇的最大遷移量的安全評(píng)估結(jié)果如表4。結(jié)果表明，有8 種奶襯制品遷出BT，相應(yīng)的EDI均超過(guò)安全閾值（0.09 mg/（person·day）），對(duì)人體健康產(chǎn)生危害的可能性較高，需引起關(guān)注。

圖4 不同遷移時(shí)間下橡膠奶襯（R1 ～R10）中苯并噻唑向50%乙醇中的遷移量Fig.4 Migration amounts of BT from rubber liners（R1-R10）to 50%ethanol at different migration test

表4 苯并噻唑的安全評(píng)估結(jié)果Table 4 The safe assessment results of BT

對(duì)同一根奶襯通過(guò)多次重復(fù)使用實(shí)驗(yàn)研究奶襯中5 種化合物向50%乙醇的遷移規(guī)律。結(jié)果表明，隨著使用次數(shù)的增加，奶襯中5 種化合物的遷移量變化不穩(wěn)定，總體呈減少趨勢(shì)。對(duì)于SML 為不得檢出的ANI和NMA，使用60次均有檢出；DPG和MBT使用60次均有檢出，但在限量范圍內(nèi)，安全可控。

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定食品接觸用橡膠奶襯中5 種化合物的方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，檢出限低于法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)中的特定遷移限量要求，具有較強(qiáng)的適用性，可為奶襯等相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。利用該方法對(duì)市售10種奶襯進(jìn)行了模擬遷移實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)奶襯中5 種化合物均有遷出，二苯胍和2-巰基苯并噻唑的遷移量在限量范圍內(nèi)且安全可控；苯并噻唑的檢出需引起關(guān)注；苯胺、N-甲基苯胺的遷移量高于遷移限量，有必要改進(jìn)配方或工藝來(lái)控制其生成。