楊志敏，常巧英，李 堅(jiān)，許曉輝，薛華麗，朱仁愿

（1.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，食品中農(nóng)藥獸藥殘留監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；4.天津科技大學(xué)省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

黨參（Codonopsis radix）屬桔?？浦参?，是多年生草本植物黨參屬的根，為藥食兩用的道地藥材，具有補(bǔ)中益氣、生津止渴、健脾益肺之功效［1］。黨參在種植、加工及儲(chǔ)存過程中，需用化學(xué)農(nóng)藥抑制或防止病蟲害，以保障其產(chǎn)量和質(zhì)量，但農(nóng)藥的不規(guī)范使用不可避免地會(huì)導(dǎo)致殘留的發(fā)生。近年來，農(nóng)藥殘留問題已成為社會(huì)各方面關(guān)注的焦點(diǎn)。《中國藥典》對中藥材中農(nóng)藥殘留限量做出規(guī)定的農(nóng)藥數(shù)量只涉及33 種，GB 2763-2021 《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［2］也未針對黨參中農(nóng)藥殘留做出限量規(guī)定，只有較少農(nóng)藥在藥用植物中有限量規(guī)定。因此，建立黨參中農(nóng)藥多殘留的分析方法具有重要意義。

目前，中藥材中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法［3-6］、液相色譜法［7］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［8-12］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［13-17］、飛行時(shí)間質(zhì)譜法［18-20］、拉曼光譜法［21］等，與之相關(guān)的前處理方法有固相萃取法、固相微萃取法、液液微萃取法、分散固相萃取法等［3-21］。其中，分散固相萃取法因操作簡單、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境、中藥材等領(lǐng)域。該方法利用凈化劑吸附基質(zhì)中的雜質(zhì)達(dá)到凈化目的。目前常用的凈化劑有N-丙基乙二胺（PSA）硅烷化硅膠、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳（GCB）吸附劑，主要用于含水量高、基質(zhì)簡單的樣品，對于復(fù)雜基質(zhì)的樣品有待探索使用新型吸附劑。碳納米管（CNTs）是碳六元環(huán)構(gòu)成的類石墨平面卷曲而成的納米級中空管［22］，因化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、比表面積大、吸附力強(qiáng)、易于改性和修飾等特點(diǎn)，近年來在農(nóng)藥多殘留的前處理檢測技術(shù)中顯示了優(yōu)異的特性［23-24］。

黨參中含有大量的色素、黨參苷、脂類、多糖、生物堿等成分［25］，而農(nóng)藥殘留含量往往很低，有效去除雜質(zhì)干擾是實(shí)現(xiàn)痕量分析準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。目前關(guān)于黨參中農(nóng)藥殘留的測定方法主要有氣相色譜法［5-6］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［15-17］、飛行時(shí)間質(zhì)譜法［20］等，其中質(zhì)譜技術(shù)在農(nóng)藥多殘留檢測中優(yōu)勢突出。黨參中農(nóng)藥殘留前處理方法鮮見利用碳納米管作為吸附材料的報(bào)道。本文以羥基多壁碳納米管（MWCNTs-OH）為凈化吸附劑，通過優(yōu)化提取溶劑、提取體系、凈化填料組合改進(jìn)前處理方法，結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）技術(shù)建立了黨參中農(nóng)藥多殘留的測定方法，為中藥材中農(nóng)藥多殘留的檢測提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B-7000D 氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；5810R 高速低溫離心機(jī)（德國Eppendor公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）；VORTEX-2渦旋振蕩器、KS40001控制型控溫?fù)u床、A11 基本型分析研磨機(jī)（德國IKA 公司）；AUTO-EVA-60 全自動(dòng)平行濃縮儀（?？萍瘓F(tuán)股份有限公司）。

無水硫酸鎂、氯化鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；PSA、C18、GCB（美國Agilent 公司）；多壁碳納米管（MWCNTs）和羥基多壁碳納米管（MWCNTs-OH）（中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司）。75種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥95.0%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）。正己烷、乙腈、乙酸乙酯（色譜純，德國Merck公司）；丙酮（色譜純，科密歐化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（西隴化工股份有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取10 mg（精確至0.01 mg）標(biāo)準(zhǔn)品分別置于10 mL 容量瓶中，用丙酮稀釋定容至刻度，于-18 ℃低溫避光保存。準(zhǔn)確移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙酸乙酯稀釋為0.4 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-18 ℃避光保存。

稱取黨參空白樣品，按照“1.3”樣品處理方法進(jìn)行提取、凈化、離心、濃縮、復(fù)溶和過膜后制備空白樣品提取液，臨用前吸取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成質(zhì)量濃度分別為5、10、25、50、100、200、300 μg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

將黨參的干燥根置于高速粉碎機(jī)中粉碎至粉末狀，過100 目篩，混勻，備用。準(zhǔn)確稱取2 g 樣品（精確至1 mg）至50 mL 離心管中，加入5.0 mL 超純水，渦旋，充分浸潤樣品，放置30 min。再加入10.0 mL 乙酸乙酯和一顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋混勻，300 r/min 振搖10 min，加入6.0 g無水硫酸鎂、1.5 g乙酸鈉，立即搖散混勻，300 r/min 振搖10 min，以4 ℃、3 900 r/min 離心5 min。取3.0 mL 上清液，置于預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管（無水MgSO4450 mg、PSA 100 mg、MWCNTs-OH 3 mg）中，渦旋使充分混勻，1 000 r/min 振蕩10 min 使凈化完全，4 ℃、3 900 r/min 離心5 min，取2.0 mL 凈化液氮吹至近干，用1.0 mL乙酸乙酯復(fù)溶，過膜，待測。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

HP-5MS UI毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升溫至170 ℃，再以10 ℃/min升溫至310 ℃并保持3 min；載氣為氦氣（純度99.999%）；進(jìn)樣量1.0 μL；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；流速：0.9 mL/min。離子源：EI源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（dMRM）掃描模式；溶劑延遲：2.5 min。75種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

對75 種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在m/z50～500 范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，使用NIST 標(biāo)準(zhǔn)庫匹配檢索，確定目標(biāo)物的保留時(shí)間，并對其前級離子、產(chǎn)物離子及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，利用軟件自帶的dMRM 模式進(jìn)一步優(yōu)化。該檢測方法可簡化分析流程，提高分析效率，適合農(nóng)藥多殘留的分析。圖1為優(yōu)化條件下75種農(nóng)藥（0.1 mg/L）的總離子流圖。

圖1 75種農(nóng)藥（0.1 mg/L）在MRM模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 75 pesticides in MRM mode（0.1 mg/L）

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇由于目標(biāo)農(nóng)藥種類多、極性差異大，因此篩選適合大多數(shù)農(nóng)藥的提取溶劑尤為重要。本實(shí)驗(yàn)分別對比了丙酮、乙酸乙酯、正己烷-丙酮（1∶1）、乙腈、1%乙酸乙腈作為溶劑提取75 種農(nóng)藥的回收率（圖2）。結(jié)果表明，回收率在70%～120%范圍內(nèi)目標(biāo)農(nóng)藥數(shù)量最多的提取溶劑為乙酸乙酯（72種農(nóng)藥），其次為乙腈（67種農(nóng)藥）。乙酰甲胺磷、樂果、硫環(huán)磷、甲基硫環(huán)磷和唑螨酯在乙酸乙酯中的回收率均在70%～120%范圍，而在乙腈中的回收率低于70%或高于120%，尤其上述4種有機(jī)磷農(nóng)藥在乙酸乙酯中的回收率顯著高于乙腈，這5種農(nóng)藥的極性均較強(qiáng)，回收率偏低可能與極性有關(guān)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇乙酸乙酯為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對提取效果的影響Fig.2 Effects of different solvent on the extraction efficiency

2.2.2 提取體系的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)涉及有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯類等多種農(nóng)藥，為防止提取過程中由于酸堿不穩(wěn)定導(dǎo)致農(nóng)藥分解，需形成緩沖鹽體系以減少農(nóng)藥的損失?？疾炝? 種提取體系（體系1：無水MgSO46.0 g + NaCl 1.5 g；體系2：無水MgSO46.0 g + NaAc 1.5 g；體系3：無水MgSO45.0g + NaCl 1.0 g + Na3C6H5O71.5 g）對75 種目標(biāo)農(nóng)藥提取效果的影響（圖3）。結(jié)果表明，第2 種提取體系的整體回收率最佳，且回收率在70%～120%范圍內(nèi)的農(nóng)藥數(shù)量最多，回收率低于70%或高于120%的農(nóng)藥較其它兩種提取體系少。因此，實(shí)驗(yàn)以無水MgSO46.0 g + NaAc 1.5 g 為最佳提取體系。

圖3 不同提取體系對提取效果的影響Fig.3 Effects of different solution system on the extraction efficiency

2.2.3 吸附劑種類的考察固定無水MgSO4450 mg 和PSA 100 mg，考察了不添加其它吸附劑和分別添加30 mg C18、GCB、MWCNTs、MWCNTs-OH 吸附劑5 種方案的凈化效果，發(fā)現(xiàn)添加GCB 和MWCNTs-OH 兩種方案的回收率在70%～120%范圍內(nèi)的農(nóng)藥數(shù)量最多，考慮到實(shí)驗(yàn)成本，選擇無水MgSO4、PSA和MWCNTs-OH為凈化吸附劑。

2.2.4 MWCNTs-OH 用量的選擇固定無水MgSO4為450 mg，PSA 為100 mg，將3 mL 提取液分別加入凈化管中，考察了MWCNTs-OH 不同用量（0、3、5、10、20、30、40 mg）對農(nóng)藥回收率的影響（見圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MWCNTs-OH 用量為3 mg時(shí)，回收率在70%～120%的農(nóng)藥數(shù)量最多。因此，本實(shí)驗(yàn)以MgSO4450 mg+PSA 100 mg+MWCNTs-OH 3 mg為最佳凈化劑組合。

圖4 MWCNTs-OH用量對凈化效果的影響Fig.4 Effects of amount of MWCNTs-OH on the purification efficiency

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限及定量下限采用本方法對質(zhì)量濃度分別為5、10、25、50、100、200、300 μg/L 的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/L），對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，75 種農(nóng)藥在5～300 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均不低于0.996 1。以陰性樣品加標(biāo)處理后采用本方法進(jìn)行檢測，得到檢出限（S/N= 3）為0.001～0.054 mg/kg，定量下限（S/N= 10）為0.002～0.178 mg/kg（見表1），符合多數(shù)農(nóng)藥殘留的篩查要求。

2.3.2 準(zhǔn)確度與精密度向陰性樣品中分別添加0.025、0.05、0.20、0.50 mg/kg 4 個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)4 次，采用本方法測定并計(jì)算各農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率。75 種農(nóng)藥在黨參中的平均回收率為69.7%～113%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=4）為0.64%～6.7%（見表1），方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足農(nóng)藥多殘留分析的要求。

表1 75種農(nóng)藥的保留時(shí)間、MRM參數(shù)、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量下限、平均加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=4）Table 1 Retention times，MRM parameters，correlation coefficients，LODs，LOQs，average recoveries and RSDs（n=4）of 75 pesticides

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之差，除以溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值。當(dāng)ME 為正值時(shí)，呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；反之則呈基質(zhì)減弱效應(yīng)。當(dāng)ME 小于20%時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)較弱，可忽略不計(jì)；ME 大于50%時(shí)，呈強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)；ME 在20%～50%范圍，則為中等基質(zhì)效應(yīng)?？疾炝?5種農(nóng)藥在黨參中的基質(zhì)效應(yīng)（圖5），結(jié)果表明，93%的農(nóng)藥為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，7%的農(nóng)藥為基質(zhì)減弱效應(yīng)。其中57%的農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)可忽略，19%的農(nóng)藥為中等基質(zhì)效應(yīng)，24%的農(nóng)藥為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。為彌補(bǔ)基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的差異，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

圖5 75種農(nóng)藥在黨參中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.5 Matrix effects of 75 pesticides in codonopsis radix

2.5 實(shí)際樣品檢測

采用本方法檢測購自中藥市場、藥店的30批黨參樣品，結(jié)果顯示，在7批樣品中共檢出6種農(nóng)藥，其中1 批樣品檢出甲拌磷（0.563 mg/kg），1 批樣品檢出二嗪磷（0.112 mg/kg）和氯唑磷（0.120 mg/kg），1批樣品檢出四氯硝基苯（0.013 mg/kg）和五氯硝基苯（0.312 mg/kg），2批樣品檢出甲基異柳磷（含量分別為0.014、0.018 mg/kg），2 批樣品檢出氯唑磷（含量分別為0.511、1.68 mg/kg）；其余樣品均未檢出?！吨袊幍洹?020年版規(guī)定了33種農(nóng)藥的最大殘留限量，其中甲拌磷、氯唑磷和甲基異柳磷的限量分別不得超過0.02 mg/kg、0.01 mg/kg和0.02 mg/kg，本文檢出的甲拌磷、氯唑磷均超標(biāo)；甲基異柳磷未超標(biāo)；《中國藥典》未規(guī)定其它3種農(nóng)藥的殘留限量，故參照GB 2763-2021標(biāo)準(zhǔn)，其中四氯硝基苯參照馬鈴薯的限量為20 mg/kg，五氯硝基苯參照根莖類調(diào)味料的限量為2 mg/kg，二嗪磷參照白術(shù)（鮮）的限量為0.3 mg/kg，上述3種農(nóng)藥的殘留量均未超標(biāo)；二嗪磷若參照白術(shù)（干）的限量0.1 mg/kg，超標(biāo)。

3 結(jié) 論

本文針對黨參中農(nóng)藥多殘留檢測的前處理?xiàng)l件進(jìn)行了深入研究，利用新型凈化劑羥基多壁碳納米管優(yōu)化凈化填料組合，提高了凈化效果。將改進(jìn)的前處理方法與GC-MS/MS聯(lián)用構(gòu)建了黨參中農(nóng)藥多殘留的高通量檢測方法。該方法操作簡單、準(zhǔn)確靈敏且經(jīng)濟(jì)適用，為黨參中農(nóng)藥多殘留的快速篩查檢測提供了可靠的分析手段。