岳 寧，李曉慧，李敏潔，王 琦，邵 華，鄭鷺飛，王 靜，金 芬

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

我國是苯脲類農(nóng)藥的生產(chǎn)和使用大國，苯脲類農(nóng)藥主要用作除草劑和殺蟲劑，其中苯脲類除草劑（Phenylurea herbicides，PUHs）作為光合系統(tǒng)電子傳遞抑制劑，在世界范圍內(nèi)廣泛使用，主要用于防治果園及大田作物中的禾本科雜草和闊葉雜草［1］；而苯甲酰脲類殺蟲劑（Benzoylurea insecticides，BPUs）主要是在PUHs 的結(jié)構(gòu)骨架上引入苯甲?；望u素取代基［2］，可干擾目標(biāo)害蟲的幾丁質(zhì)合成［3］，是防治農(nóng)產(chǎn)品抗性害蟲的主要農(nóng)藥品種之一。然而，苯脲類農(nóng)藥的水溶性高，多具有內(nèi)吸性，在土壤中殘留的半衰期長，對農(nóng)產(chǎn)品和地下水可能造成污染［4-8］。美國環(huán)境保護(hù)總局（EPA）將敵草隆和殺鈴脲等苯脲類農(nóng)藥定為Ⅲ類毒性或Ⅳ類毒性［9］，歐盟也將其列入優(yōu)先控制污染物清單［10-11］。近年來，苯甲酰脲類殺蟲劑作為第三代殺蟲劑，以獨特的作用機(jī)制和高效的殺蟲活性，成為新型農(nóng)藥創(chuàng)制活躍領(lǐng)域之一［12］。為應(yīng)對新型化合物的發(fā)現(xiàn)和預(yù)警需求，有必要建立農(nóng)產(chǎn)品中苯脲類農(nóng)藥的非靶向快速篩查方法。

現(xiàn)有關(guān)于農(nóng)產(chǎn)品以及水體中苯脲類農(nóng)藥的殘留分析方法均為靶向分析技術(shù)［13-14］，無法實現(xiàn)對新型苯脲類農(nóng)藥的快速非靶向篩查。近年來，超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLCQ/Orbitrap HRMS）由于具有分析時間短、選擇性高及分辨率高等特點［15］，在新型危害物和天然產(chǎn)物質(zhì)譜裂解規(guī)律研究中的應(yīng)用日益增多。目前，該技術(shù)已成功用于農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷類等農(nóng)藥殘留、蘇丹紅等食品添加劑及大環(huán)內(nèi)酯類等獸藥殘留的快速非靶向篩查［16-18］。然而，目前尚無基于質(zhì)譜特征碎裂規(guī)律的苯脲類農(nóng)藥殘留高分辨質(zhì)譜快速篩查方法的報道。

本研究采用UPLC-Q/Orbitrap HRMS 技術(shù)解析了13 種PUHs 和9 種BPUs 共22 種苯脲類農(nóng)藥的特征離子碎片和特征中性丟失。將22 種苯脲類農(nóng)藥按取代基的不同分為4 類，并分析了其主要裂解途徑、特征碎片離子和規(guī)律，并將基于該特征裂解規(guī)律的篩查方法應(yīng)用于北京市售蘋果中苯脲類農(nóng)藥的非靶向篩查，為苯脲類農(nóng)藥殘留的快速篩查提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（Vanquish Flex UHPLC Systems，美國Thermo Fisher 公司）；四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（Q Exactive HF-HRMS 質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher 公司）；Milli-Q 超純水器（美國Millipore公司）。

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，購自美國Fisher 公司。N-丙基乙二胺（PSA，50 μm）、十八烷基鍵合硅膠（C18，50 μm）分散固相萃取吸附劑，購自美國Sigma-Aldrich 公司；13 種苯脲類除草劑標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞98.7%，購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司；9 種苯甲酰脲類殺蟲劑標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。12 批紅富士蘋果樣品分別于2021 年10 月購自北京地區(qū)的3 個超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取13 種苯脲類除草劑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容配成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；準(zhǔn)確量取13種苯脲類除草劑和9種苯甲酰脲類殺蟲劑的儲備液（100 μg/mL），用甲醇稀釋定容配制成200 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，待分析。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱：Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）。柱溫：40 ℃；流動相：A 相為0.1%的甲酸水溶液，B 相為甲醇；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。流動相梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%A；1.0～2.0 min，90%～70%A；2.0～4.0 min，70%～40%A；4.0～5.0 min，40%～0%A；5.0～9.0 min，0%A；9.0～9.1 min，0%～90%A；10.0 min，90%A。

質(zhì)譜條件：離子源：熱電噴霧離子源（HESI）；離子模式：正離子；歸一化碰撞能（NCE）：20%、40%、60%；鞘氣流速：40 Arb；輔助氣流速：10 Arb；噴霧電壓：3.50 kV；毛細(xì)管溫度：320 ℃；輔助氣加熱溫度：300 ℃；脫溶劑氣和錐孔氣：氮氣。標(biāo)準(zhǔn)品掃描模式：平行反應(yīng)監(jiān)測模式（PRM）：通過Xcalibur Instrument Setup 軟件界面Global lists 中Iclusion List 輸入22 種苯脲類化合物的分子式；分辨率：90 000；S-lens電壓：55 V；隔離窗口：2.0 u；樣品掃描模式：數(shù)據(jù)采集使用一級母離子全掃描和數(shù)據(jù)依賴的二級子離子掃描模式（Full MS/dd-MS2），質(zhì)量掃描范圍m/z100 ～1 500。一級分辨率：70 000，二級分辨率：17 500。自動增益控制進(jìn)入軌道阱中的離子數(shù)（AGC target）為1e6，最大注入時間為100 ms。

1.4 樣品前處理

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 20769-2008［19］進(jìn)行樣品前處理。準(zhǔn)確稱取10.00 g（精確至0.01 g）樣品勻漿于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈混合，渦旋（轉(zhuǎn)速為2 000 r/min）提取5 min，放冷，在室溫條件下以6 000 r/min離心5 min。取1 mL上清液加入裝有30 mg PSA和25 mg C18凈化劑混合物的2 mL塑料離心管中，渦旋5 min 后，在室溫條件下以6 000 r/min 離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，供進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 正離子模式下苯脲類農(nóng)藥的質(zhì)譜分析

根據(jù)基本結(jié)構(gòu)骨架，苯脲類農(nóng)藥可分為苯脲類除草劑（PUHs）和苯甲酰脲類殺蟲劑（BPUs）兩大類。其中PUHs 的基本結(jié)構(gòu)骨架由脲基和苯環(huán)兩部分構(gòu)成（圖1A）；而BPUs 是在PUHs 的結(jié)構(gòu)骨架基礎(chǔ)上引入苯甲?；钚詠喗Y(jié)構(gòu)和鹵素取代基，其基本結(jié)構(gòu)骨架包括苯甲?；㈦鍢蚝捅桨啡糠?。不同的BPUs結(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在酰胺、苯甲?；捅桨飞先〈牟煌?。因此根據(jù)苯甲酰基上鹵素取代基的不同，可將BPUs 分為氟原子取代的BPUs（圖1B）和氯原子取代的BPUs（圖1C）。典型PUHs 和BPUs 中不同取代基的具體信息見表1。

圖1 苯脲類農(nóng)藥的一般結(jié)構(gòu)通式Fig.1 General structural formulas of phenylurea pesticides

表1 苯脲類農(nóng)藥結(jié)構(gòu)通式中R取代基的詳細(xì)信息Table 1 The substituents of general structural formula of phenylurea pesticides

（續(xù)表1）

本研究22 種苯脲類農(nóng)藥的分子離子精確質(zhì)量數(shù)和主要特征離子碎片的信息見表2。在正離子模式下，13 種PUHs 和9 種BPUs 均可產(chǎn)生特征明顯的準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+，其準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)與理論值的偏差小于5×10-6（表2），可作為定性依據(jù)。4 類典型PUHs 和BPUs 的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 典型PUHs（A、B）和BPUs（C、D）的二級全掃描圖Fig.2 Secondary full scan spectra of typical PUHs（A，B）and BPUs（C，D）

表2 13種苯脲類除草劑和9類苯甲酰脲類殺蟲劑的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 High resolution mass spectrometric data of 13 PUHs and 9 BPUs

2.2 質(zhì)譜裂解途徑

2.2.1 PUHs 的主要裂解途徑根據(jù)取代基R3（甲基或甲氧基）的不同，PUHs可分為2種亞型。其中，綠麥隆等9 種PUHs 的取代基R3均為甲基，其準(zhǔn)分子離子［M+H］+發(fā)生斷裂，產(chǎn)生特征碎片離子N，N-二甲基酰胺結(jié)構(gòu)［（CH3）2NCO］+（m/z72.044 59）；［M+H］+也可丟失中性分子二甲胺（m/z45.058 03）得到特征離子碎片［C6H3NHCOR1R2］+，或氫原子重排后發(fā)生脲基中碳氮鍵斷裂得到特征離子碎片［C6H3NH3R1R2］+。綠麥隆的特征離子碎片的主要裂解途徑見圖3。

圖3 綠麥隆的主要裂解途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathways of chlorotoluron

而綠谷隆、溴谷隆、利谷隆和氯溴隆等4 種PUHs 的取代基R3均為甲氧基。該亞類PUHs 的準(zhǔn)分子［M+H］+的裂解與取代基為甲基的PUHs亞型相似，均發(fā)生N-甲氧基-N-甲基甲酰胺中氫原子重排，產(chǎn)生特征性離子碎片［C6H3NH3R1R2］+；與之不同的是，取代基R3均為甲氧基的4 種PUHs 的［M+H］+也可發(fā)生脲基中氮氧鍵斷裂，分別丟失中性分子甲醇［CH3OH］和鹵化氫［HR1］，產(chǎn)生特征離子碎片［R1R2C7H6N2OCH3］+和［R2C7H6N2OCH3］+。以綠谷隆為例，特征離子碎片可能的裂解途徑見圖4。

圖4 綠谷隆的主要裂解途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathways of monolinuron

2.2.2 BPUs 的主要裂解途徑根據(jù)鹵素取代基的不同，BPUs 可分為含氟和含氯原子2 種亞型。其中，除蟲脲、氟苯脲、氟蟲脲、氟鈴脲、氟酰脲、虱螨脲和氟啶脲7種BPUs結(jié)構(gòu)中苯甲?；系柠u素取代基均為氟原子。與PUHs 相比，含氟BPUs 的準(zhǔn)分子離子［M+H］+也可發(fā)生脲橋中脲基碳氮鍵斷裂，產(chǎn)生特征離子碎片［C7H3F2ONH3］+（m/z158.040 47），該離子可進(jìn)一步提示中性分子氨產(chǎn)生特征離子碎片［C7H3F2O］+（m/z141.015 00）。此外，［M+H］+也可丟失中性分子2，6-氟苯甲酰胺結(jié)構(gòu)［C8H3F2O2NH2］（m/z183.013 21），產(chǎn)生特征離子碎片［C7H2NOR1R2R3R4］+。以除蟲脲為例，特征離子碎片可能的裂解途徑見圖5。

圖5 除蟲脲的主要裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathways of diflubenzuron

殺鈴脲和滅幼脲為含氯的BPUs，其準(zhǔn)分子離子［M+H］+的裂解途徑與含氟的BPUs類似，但由于結(jié)構(gòu)中苯甲酰基上的鹵素取代基與除蟲脲等不同，［M+H］+裂解產(chǎn)生的部分特征碎片離子的質(zhì)荷比有所不同，分別為［C7H3ClONH3］+（m/z156.020 22）和［C7H3ClO］+（m/z138.993 82）。與上述苯脲類農(nóng)藥不同的是，殺鈴脲和滅幼脲還存在特征碎片離子［C6H5Cl］+（m/z113.015 28），這可能是苯甲酰基結(jié)構(gòu)中?；c苯環(huán)相連的碳碳鍵斷裂后形成共軛結(jié)構(gòu)所致。以殺鈴脲為例，特征離子碎片可能的裂解途徑見圖6。

圖6 殺鈴脲的主要裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathways of triflumuron

2.3 實際樣品測定

應(yīng)用上述裂解規(guī)律，對北京市售12 批蘋果樣品進(jìn)行Full MS/dd-MS2模式下的二級離子碎片全掃描，在1 份蘋果樣品中檢測到離子碎片m/z72.044 59 和m/z168.020 85，準(zhǔn)分子離子為m/z213.078 96的可疑化合物。根據(jù)標(biāo)識性離子碎片m/z72.044 59推測，該化合物可能是一種苯脲類除草劑，推測碎片m/z168.026 85由準(zhǔn)分子離子m/z213.078 96中性丟失（CH3）2NH（m/z45.058 03）產(chǎn)生，因此樣品中可能含有綠麥隆。進(jìn)一步采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗證，綠麥隆標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為4.96 min，母離子為m/z213.078 90，子離子為m/z72.044 59、168.020 89、140.999 82。而在實際樣品中，該物質(zhì)的保留時間為4.97 min，母離子為m/z213.078 96，子離子為m/z72.044 59、168.020 85，與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間以及二級質(zhì)譜信息一致，由此確定樣品中含有綠麥隆，驗證了本文總結(jié)的苯脲類農(nóng)藥的質(zhì)譜裂解規(guī)律。

3 結(jié) 論

本文采用UPLC-Q/Orbitrap HRMS 技術(shù)在正離子模式下對22 種苯脲類農(nóng)藥的裂解規(guī)律進(jìn)行研究，根據(jù)取代基的不同，將22 種待測農(nóng)藥分為4 類，以綠麥隆為代表的9 種含甲基的苯脲類除草劑的主要特征離子碎片為m/z72.044 59，特征丟失中性分子二甲胺（m/z45.058 03）；以綠谷隆為代表的4種含甲氧基的苯脲類除草劑發(fā)生特征丟失中性分子甲醇或鹵化氫產(chǎn)生離子碎片；除蟲脲等7 種氟原子取代的苯甲酰脲類殺蟲劑的特征離子碎片為m/z158.040 47、m/z141.015 00，特征丟失中性分子2，6-氟苯甲酰胺結(jié)構(gòu)（m/z183.013 21）；殺鈴脲等2 種氯原子取代的苯甲酰脲類殺蟲劑的主要特征離子碎片為m/z156.020 25、m/z138.993 76 和m/z113.015 28?；谏鲜隽呀庖?guī)律，實現(xiàn)了蘋果中苯脲類農(nóng)藥的非靶向篩查。